NOE/NOESY의 기본: NOE가 감지되지 않을 때의 원인과 해결책

NOE(Nuclear Overhauser Effect)는 분자 내 공간적 근접 관계를 밝혀낼 수 있는 중요한 NMR 측정 기법입니다. 이 칼럼에서는 차분 NOE, 1D NOESY, 2D NOESY의 차이점과 각 방법을 선택하는 방법, 그리고 분석에 중요한 완화 시간에 대해 논의합니다. NOE가 검출되지 않는 경우의 원인과 해결책도 다룹니다. 또한, 자주 묻는 질문에 답하고 NOE 측정을 효과적으로 활용하기 위한 핵심 사항을 설명합니다.

NOE 측정이란?

NOE(Nuclear Overhauser Effect) 측정은 공간적으로 가까운 거리에서 핵을 관찰하는 방법입니다. NOE 측정은 분자의 입체화학을 얻고, 이성질체를 구별하며, 치환기의 위치를 ​​확인하여 저분자 화합물의 응용에 활용됩니다.

NOE의 원칙

NOE는 공간적으로 가까운 핵이 자기적으로 서로 영향을 미쳐 NMR 신호 강도 변화를 일으키는 현상입니다.

NOE를 고려하면, 위 그림에서 보듯이 하나의 분자 안에 두 개의 양성자가 있다고 생각해 보세요.
이들 양성자가 서로 가까울 때, 쌍극자 상호작용으로 인해 NOE가 관찰됩니다.
반면, 양성자 사이의 거리가 멀면 쌍극자 상호작용이 없으므로 NOE가 관찰되지 않습니다.
쌍극자 상호작용은 핵간 거리 및 분자 이동성과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있으며, 두 핵 사이의 거리가 6Å보다 짧으면 NOE가 관찰될 수 있습니다.
반면, 상호작용의 크기는 핵간 거리(r)의 마이너스 6승(r-)에 비례하므로⁶), 핵간 거리가 증가하면 상호작용이 급격히 감소하여 NOE를 관찰하기 어렵게 됩니다.

NOE 관찰 방법

스핀 결합에 의한 분리와는 달리, NOE는 지금까지 소개한 NMR 스펙트럼(1D, 2D NMR)에서는 관찰되지 않습니다.
따라서 NOE 측정을 위해서는 다음과 같은 단계가 필요합니다.

• 특정 양성자에 전파 조사(여기/포화)

• 다른 양성자의 신호 강도 변화 관찰

• 이 변화가 NOE에서 오는 것인지 판단해 보세요.

NOE 측정 유형

NOE 측정에는 세 가지 주요 유형이 있습니다.

• NOE 차이: 전파 조사 유무에 따른 스펙트럼 차이를 측정하여 정상 상태의 NOE를 관찰합니다.

• 2D NOESY: 2D 스펙트럼을 사용하여 과도 NOE를 관찰합니다.

• 1D NOESY: 양성자를 선택적으로 여기시키고 1차원에서 과도 NOE를 관찰합니다.

정상 상태 NOE는 장시간 동안 전파를 조사하여 특정 양성자를 포화시키고, 포화 상태가 정상 상태가 되면 다른 양성자의 신호 강도 변화를 관찰하는 것입니다.
스핀 상태가 짧은 기간의 전파 조사에 의해 일시적으로 변화한 후 혼합 시간 동안 과도적인 NOE가 관찰됩니다.
NOE가 생성되는 메커니즘이 다르므로 각 방법의 특성을 고려하여 측정 조건을 결정해야 합니다.

NOE 측정 차이

차이 NOE 측정은 특정 양성자에 전파를 조사했을 때와 조사하지 않았을 때의 스펙트럼 차이를 측정하여 주변 양성자의 신호 강도 변화를 확인하는 방법입니다.

위에 표시된 것처럼 두 개의 양성자, H_I 및 H_S 고려될 것입니다. H_I 및 H_S 공간적으로 가까운 거리에 있으며 쌍극자 상호작용이 있습니다.
(B)는 ¹H 스펙트럼은 H일 때_S 방사선을 조사하지 않았습니다.

여기서, 전파가 H에 조사되면_S H를 포화시키다_S, H의 신호_S 보이지 않게 됩니다. 이때 H의 신호 강도는_I H 사이의 쌍극자 상호 작용으로 인해 커집니다._I 및 H_S. 이것은 "NOE로 인한 변경"입니다.
NOE에 따른 신호강도의 변화는 매우 작으므로 (A)와 (B)의 차이를 계산하여 그 차이를 명확히 하였다.
차이 NOE로 관찰된 NOE를 "정상 상태 NOE"라고 합니다.
일반적으로 용액 내에서 분자 운동 속도가 빠른 저분자 화합물의 경우, 조사된 양성자의 신호 변화가 아래쪽으로 표현될 때 NOE 신호는 위쪽으로 관찰됩니다. 이를 "양의 NOE"라고 합니다.

에틸 크로토네이트를 사용하여 NOE 차이 측정의 실제 예를 소개합니다.

이중 결합의 형태가 시스형인지 트랜스형인지 NOE 차이 측정을 통해 확인하고자 합니다. A로 표현되는 메틸기의 양성자에 방사선을 조사하고, 그에 따른 NOE를 측정합니다.

위 그림의 상단 부분에서 ¹에틸 크로토네이트의 H ​​스펙트럼이 표시됩니다.
아래 부분에는 A의 메틸기의 양성자가 포화되었을 때의 NOE 스펙트럼의 차이를 나타낸다.
이 데이터는 400MHz 장비를 사용하여 측정되었으며 NOE 신호는 B와 C에서 위쪽으로 관찰되었습니다.

얻어진 결과에 따르면, A의 메틸기 양성자를 조사하면 B와 C에서 관찰 가능한 NOE가 발생하여 에틸 크로토네이트가 트랜스 형태를 갖는다는 것을 나타냅니다.

1D 노이지

1D NOESY는 특정 양성자를 선택적으로 여기시키고, 특정 양성자와 공간적으로 가까운 다른 양성자 사이의 과도 NOE를 1차원 스펙트럼으로 관찰하는 방법입니다.
이 측정에서는 소프트 펄스(협대역 펄스)와 펄스 필드 기울기를 사용하여 관심 있는 양성자만을 여기시키고 혼합 시간 동안 NOE의 변화를 기록합니다.
차이 NOE에서처럼 스펙트럼을 뺄 필요가 없으므로 분석하기 쉬운 스펙트럼을 얻을 수 있습니다.
1D NOESY는 관심 있는 특정 양성자가 있거나 간단한 방법으로 NOE를 확인하고 싶을 때 적합합니다.

여기서는 에틸 크로토네이트를 이용한 1차원 NOESY 측정의 예를 제시합니다. 위 그림의 (B)는 양성자 A를 선택적으로 여기시켜 얻은 1차원 NOESY 스펙트럼을 나타내고, (C)는 양성자 C를 선택적으로 여기시켜 얻은 스펙트럼을 나타냅니다.
1D NOESY는 차이 NOE 스펙트럼과 달리 전파 조사 전후에 얻은 두 스펙트럼을 뺀 나머지 신호를 나타내지 않아 스펙트럼 분석이 더 쉽습니다.

해석 방법은 NOE 차이와 비슷합니다. 선택적으로 들뜬 양성자 신호가 아래로 표시될 때 다른 신호가 어떻게 나타나는지 확인합니다.
에틸 크로토네이트의 경우, 양성자 A가 선택적으로 여기되면 B와 C에서 양의 NOE가 관찰됩니다. 반대로, 양성자 C가 여기되면 A에서만 양의 NOE가 관찰됩니다. 이러한 결과는 또한 에틸 크로토네이트가 트랜스 유형의 입체화학을 가지고 있다는 추정을 뒷받침합니다.
따라서 모호한 공간 배열로 입체화학을 결정할 때 각 부분의 선택적 여기의 1D NOESY를 측정하는 것이 중요합니다.

2D 노이지

2D NOESY는 분자 내에서 공간적으로 가까운 양성자 간의 상호작용(NOE)을 2차원 스펙트럼으로 관찰하는 방법입니다.
이 실험은 양성자 스핀 상태를 일시적으로 바꾼 후 혼합 시간 동안 NOE가 어떻게 변하는지(일시적 NOE) 관찰합니다.
얻어진 스펙트럼은 대각선상의 자기 신호와 공간적으로 가까운 양성자 사이의 상관 신호를 표현했습니다.
2D NOESY는 분자 전체에서 포괄적인 NOE 상관관계를 허용하므로 복잡한 구조 분석과 전체 신호 할당 확인에 적합합니다.

여기에서는 2D NOESY 스펙트럼을 읽는 방법을 설명하겠습니다. 위 그림에서 볼 수 있듯이 A와 C, B와 D가 서로 가까이 있을 때 이러한 상관 신호가 나타납니다.
X축 방향으로 위치 A와 B(파란색 점선)에서 슬라이스된 데이터는 각각 A와 B의 선택적 여기를 통한 1D NOESY 스펙트럼과 동일합니다.

이 그림은 에틸 크로토네이트의 2D NOESY를 보여줍니다.
각 슬라이스 데이터를 살펴보면, 선택적으로 여기된 부분의 신호(빨간색)는 아래쪽으로 나타나는 반면, NOE 상관관계가 있는 신호(검은색)는 위쪽(양의 NOE)으로 나타납니다.
검은색의 상관관계 신호를 살펴보면 다음과 같은 NOE 상관관계를 찾을 수 있습니다.

A：B와 C
비：아
C：A
디：이
이：디

또한 A, B, C 간의 NOE 상관관계에 초점을 맞춘 결과, 트랜스 유형 구조의 존재가 뒷받침되며, 이는 앞서 언급한 NOE 및 1D NOESY 결과의 차이와 일치합니다.

NOE 측정 방법 선택을 위한 간단한 가이드라인

앞서 설명했듯이 NOE 측정의 경우 목적에 맞는 방법을 선택할 수 있습니다.
조건 설정이 쉽고 선명한 스펙트럼을 얻을 수 있는 1D NOESY로 시작하는 것이 좋습니다.
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목표 양성자가 지정되었습니다: 1D 측정
분자 전체에서 NOE를 보고 싶거나 신호 할당이 불확실한 경우: 2D NOESY
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NOE 측정의 중요 요소: 이완 시간

NOE 측정에서 가장 실망스러운 문제 중 하나는 의심할 여지 없이 "NOE 신호가 감지되지 않을 때"입니다.
이런 경우에는 종방향 이완시간(T)을 측정해 주세요.₁)을 먼저 대상 샘플로 설정합니다.
그러면, NOE 차이 측정을 위해서는 여기 펄스의 조사 시간을 T의 5배 이상으로 설정해 주세요.₁ 대상 샘플의.
또한 1D/2D-NOESY의 혼합시간을 T의 약 0.8배로 설정해주세요.₁ 대상 샘플의.

그러면 NOE 측정을 위해 대상 샘플의 이완 시간을 고려해야 하는 이유는 무엇일까요?
이는 NOE가 쌍극자 상호작용에 기반한 이완 현상이기 때문에 NOE가 이완 시간과 깊은 관련이 있기 때문입니다.

여기서는 NMR에서의 이완에 대해 간단히 설명하고자 합니다.

위는 스핀 수가 1/2일 때 핵 스핀의 에너지 준위를 나타낸 개략도입니다.
정적 자기장에 놓이면, 핵 스핀은 자기장의 영향을 받아 제만 분리를 거친 후 두 개의 에너지 상태를 차지하게 됩니다.
에너지가 낮은 안정 상태를 α 상태라고 하고, 에너지가 높은 상태를 β 상태라고 합니다.
이 에너지 갭과 동일한 주파수의 전파를 조사하면 α상태의 스핀이 전파의 에너지를 흡수하여 β상태로 여기된다.
전파를 조사하여 α 상태와 β 상태의 스핀 수가 같아지면 에너지 흡수가 멈추는데, 이를 포화 상태라고 합니다.
포화 상태에서 β 상태의 스핀은 에너지를 방출하고 α 상태로 돌아가며, 마침내 열 평형 상태로 돌아갑니다. 이 모든 과정을 이완이라고 합니다.
그러면 여기부터 이완까지 이어지는 일련의 과정을 우리가 관찰하는 NMR 현상이라고 합니다.

두 개의 인접한 핵 스핀 사이에 작용하는 상호작용이 앞서 설명한 이완의 원동력입니다. 용액 NMR에서 쌍극자 상호작용은 이완을 촉진하는 주요 요인 중 하나입니다. 따라서 쌍극자 상호작용과 밀접한 관련이 있는 이완 시간 매개변수를 설정하는 것은 성공적인 NOE 관찰을 위한 중요한 열쇠입니다.

감지되지 않는 NOE 신호의 원인 및 해결 방법

NOE가 검출되지 않을 경우의 원인과 대책은 다음의 4가지 항목에서 설명됩니다.

• 샘플 조정/측정 조건 최적화

• 분자 운동 변경

• 공진 주파수 변경

• 측정 방법 변경

먼저 1.이 최적화되었는지 확인하고, NOE가 관찰되지 않으면 2~4를 시도해 보세요.

1. 샘플 조정/측정 조건 최적화

NOE 신호는 매우 약하므로 결과는 시료 농도 및 순도, 측정 조건 설정에 크게 영향을 받습니다.

• 농도: 농도가 너무 높으면 분자 간에 이완이 일어나 NOE가 약해지는 경향이 있습니다.

• 상자성 물질 오염에 대한 주의: 용존산소 및 금속이온(Fe, Cu 등)_C.) 이완을 촉진하여 NOE를 예방합니다.

• 조사/혼합 시간 설정: T 기준₁(종방향 이완시간), 5배 이상의 조사시간, 약 0.8배의 혼합시간이 지침입니다.

2. 분자 운동 변화

NOE의 강도는 분자 운동에 따라 달라집니다.
다음 그래프는 NOE 강도와 분자 운동 사이의 관계를 보여줍니다.

이 곡선은 이론적으로 NOE 강도와 쌍극자 상호작용의 관계식에서 도출되었습니다.

세로축은 NOE 강도를 나타내고, 가로축은 관찰 빈도 ω에 분자 상관 시간 t를 곱한 값을 나타냅니다._C.
t_C 는 분자가 용액 속에서 한 바퀴 회전하는 데 걸리는 시간이며, 분자의 운동을 나타내는 매개변수입니다. 즉, 분자가 작을수록 t가 짧아집니다._C 됩니다. 분자가 클수록 t가 길어집니다._C 됩니다.

왼쪽은 t가 있는 저분자 영역을 보여줍니다._C 짧고 분자의 운동이 빠릅니다. 여기서는 양의 NOE가 관찰됩니다.
반면, 오른쪽은 t가 있는 폴리머 영역을 보여줍니다._C 길고 분자의 운동은 느립니다. 여기서는 음의 NOE가 관찰됩니다. 즉, 그래프는 분자의 운동에 따라 NOE 강도가 크게 변함을 나타냅니다.

측정을 수행할 때 중요한 것은 NOE가 0이 되는 영역이 있다는 것입니다.
분자가 관찰 주파수 ω와 분자의 상관 시간 t의 곱의 영역에 가까울 때_C 1이면 NOE가 매우 약해지거나 NOE가 관찰되지 않습니다.

따라서 귀사의 기기로 측정 조건을 검토하여도 NOE가 관측되지 않을 경우, 관측 주파수 ω와 분자의 상관시간 t의 곱이_C 이 지역에 있습니다.

이런 경우 ω 또는 t를 변경하면_C 가능한 선택입니다.
하지만 ω를 바꾸면 측정 자기장도 바뀌게 되므로, 측정기를 하나만 들고 있다면 한꺼번에 시도하기 어려울 수 있습니다.
따라서 t를 변경하는 것을 고려하는 것이 좋습니다._C 즉, t에 영향을 줄 수 있는 요소를 변경하는 것입니다._C(용매의 온도와 점도를 측정).
먼저 측정 온도를 변경하는 것이 좋습니다.

3. 공진 주파수 변경

다음으로 관측 주파수가 바뀌는 경우, 즉 측정 자기장이 바뀌는 경우에 대해 설명하겠습니다.

위 그림은 NOE 강도와 상관 시간 t에 따른 자기장 의존성을 보여줍니다._C 수직축은 NOE 강도를 나타내고 수평축은 상관 시간 t를 나타냅니다._C각 곡선은 90MHz에서 920MHz까지의 자기장에 해당합니다. 측정 자기장이 증가함에 따라 곡선은 왼쪽으로 이동합니다. t에 초점을 맞추면_C NOE가 0이 되는 지점에서, 자기장이 증가함에 따라 신호 강도가 0이 되는 지점이 분자가 낮은 영역(분자가 빠르게 움직이는 영역)으로 이동하는 것을 볼 수 있습니다.
이는 동일한 측정 조건에서 양의 NOE 신호 강도가 높은 자기장에서 약해진다는 것을 의미합니다. 예를 들어, 600MHz 장비에서 NOE가 0인 분자가 300MHz 장비에서는 양의 NOE로 관측될 수 있습니다. 또한, 분자량이 약 1000인 분자의 경우, NOE가 매우 작은 원 안에 존재할 가능성이 높으므로 주의가 필요합니다.

4. 측정방법 변경

지금까지 소개한 방법 1~3을 시도한 후에도 NOE가 관찰되지 않으면 ROESY라는 측정 방법을 사용합니다. ROESY는 회전 좌표계에서의 NOE 측정입니다.

위 그림은 90°C에서 측정한 그라미시딘 S의 1D NOESY 및 1D ROESY 스펙트럼입니다.
이 온도에서 그라미시딘 S의 NOE는 거의 0이 되지만, ROESY를 사용하면 상관관계 신호를 관찰할 수 있습니다. ROESY에서 관찰된 NOE를 ROE라고 합니다. ROESY의 가장 큰 장점은 모식도에서 볼 수 있듯이 ROE가 항상 양의 값을 가지며 0 영역을 갖지 않는다는 것입니다.
"그럼 처음부터 ROESY를 사용하면 안 되는 건가요?"라고 생각하실 수도 있습니다. 하지만 ROESY는 더욱 세심한 파라미터 설정이 필요하고 원치 않는 신호를 생성하는 경향이 있습니다. 따라서 NOESY가 제대로 작동하지 않을 때는 ROESY를 사용하는 것이 더 좋습니다.

NOE 측정에 대한 자주 묻는 질문

• NOE 신호의 모양이 이상해 보여요!!

  차이 NOE 측정 시, 조사 위치를 피크 최대값으로 설정하지 않으면 스핀 결합 효과가 발생하여 신호 형태가 변할 수 있습니다. 따라서 조사 위치를 피크 최대값으로 정확하게 설정해야 합니다.

  

  차이 NOE 측정에서, 더블릿보다 많은 멀티플릿에 선택적으로 방사선이 조사되고, 조사 위치가 피크 최대점에서 이동하면 신호 모양이 변합니다. 위의 두 스펙트럼은 에틸 크로토네이트의 메틸기 양성자에 방사선이 조사되었을 때의 차이 NOE 결과를 보여줍니다. B와 C에서 양의 NOE 신호가 관찰됩니다. 조사 위치가 피크 최대점 대신 신호 A의 중앙 ppm 부근으로 이동하면, 상단 스펙트럼의 점선 영역에 표시된 것처럼 크고 비대칭적인 잔류 신호가 나타납니다. 이는 양성자 B와의 스핀 결합 상호작용 때문입니다. 차이 NOE 측정에서는 항상 피크 최대점에서 방사선 조사 위치를 선택하십시오.

• 소분자가 음의 NOE를 나타내는 이유는 무엇입니까?

  이러한 현상은 간접 NOE(3스핀 효과)로 알려져 있으며, 작은 분자에서는 양성자가 거의 선형으로 배열되어 있을 때 관찰할 수 있습니다.

  

  일반적으로 용액 속에서 빠르게 움직이는 작은 분자는 양의 NOE 신호를 나타냅니다. 그러나 이 신호는 때때로 음의 NOE와 같은 방향으로 나타날 수 있습니다. 예를 들어, 왼쪽 그림과 같이 양성자 AB와 BC는 공간적으로 가깝지만 AC는 멀리 떨어져 있는 공간 배열을 생각해 보겠습니다. 오른쪽 그림은 양성자 A가 선택적으로 여기되었을 때의 1차원 NOESY 스펙트럼을 보여줍니다. A와 B가 가깝기 때문에 B에서 양의 NOE가 관찰됩니다. 그러나 B를 거쳐 C에서도 간접적인 NOE가 나타날 수 있습니다. 이 간접적인 NOE는 양의 NOE와 반대 방향으로 나타납니다. 이 신호가 AC가 공간적으로 가깝다는 것을 나타내는 것은 아니라는 점에 유의해야 합니다. 이 현상은 세 양성자가 공간적으로 거의 선형적으로 배열될 때 발생할 가능성이 가장 높으며, 이를 "3-스핀 효과"라고 ​​합니다.

• 거리가 가까워야 하는데도 NOE를 이용할 수 없는 이유는 무엇입니까?

  세 개의 양성자가 공간적으로 특수하게 배열되어 있으면, 거리가 가깝더라도 NOE를 관찰할 수 없을 수도 있습니다.

  

  3스핀 효과의 특수한 사례로 삼각형 문제를 설명하겠습니다. 위 그림에서 보듯이, 세 개의 양성자가 공간적으로 특수하게 배열될 때 이 문제가 발생할 수 있습니다.

  

  A가 선택적으로 여기될 때, A와 B 사이의 거리뿐만 아니라 A와 C 사이의 거리도 가까워집니다. 따라서 A와 C 사이에 양의 NOE가 나타나야 하며, 예측된 스펙트럼은 위 그림의 오른쪽에 있습니다.

  

  그러나 주황색으로 표시된 A에서 C까지의 양의 NOE와 녹색으로 표시된 B를 통한 간접 NOE는 서로 상쇄되어 관찰 가능한 NOE가 발생하지 않습니다.
  이론적으로 이러한 상쇄는 각 양성자 쌍 사이의 거리 비율이 1:1:1.26일 때 발생합니다. 즉, 양성자가 공간적으로 가깝더라도 NOE는 관측되지 않을 수 있습니다.

참조

Claridge, DWT(2004), *Yūki kagaku no tame no kōbun Kainou NMR tekunikku* [유기 화학을 위한 고해상도 NMR 기술](T.Takeuchi & M. Nishikawa(Trans.) Kodansha Scientific.

Fukushi, E.&Sohmiya H.(2007), *Korenara wakaru nijigen NMR* [2D NMR 이해가 쉬워졌습니다]. 카가쿠 동인.

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