COSY/TOCSY 분석│2D NMR을 이용한 스핀 상관관계 해석

이 칼럼에서는 2D NMR의 대표적인 기법인 COSY와 TOCSY의 기본 원리와 분석 방법을 설명합니다. COSY를 이용한 인접 양성자 간의 상관관계 확인부터 시작하여, TOCSY를 이용한 스핀 네트워크 분석, 그리고 1D 및 2D TOCSY를 이용한 탄수화물 분석까지 구체적인 예시와 함께 소개합니다.

COSY란 무엇일까요?

COSY(상관 분광법)는 인접한 분자들 사이의 결합을 시각화하는 기본적인 방법입니다. ¹2D NMR을 사용하여 Hs를 분석합니다. 전통적으로는 호모디커플링을 사용합니다. ¹Hs는 인접한 위치를 찾는 데 사용되었습니다. ¹수소 원자를 하나씩 분석해야 했습니다. 하지만 COSY 기법의 등장으로 이러한 방식이 가능해졌습니다. ¹H-¹COSY는 넓은 범위에 걸쳐 수소 원자 간 커플링 상관관계를 동시에 측정할 수 있어 구조 분석 효율을 획기적으로 향상시킵니다. 현재 COSY는 구조 확인을 위한 입문 2D NMR 방법으로 널리 사용되고 있습니다. ¹H-¹H 상관관계.

그림 1은 해당 영역에 대한 COSY 스펙트럼을 보여줍니다. ¹"신남산 시스-3-헥세닐 에스테르"에서 1~6번째 Hs. 위에서 언급한 바와 같이 상관 신호와 ¹1차원 H 스펙트럼의 두 축이 연결되어 있으며, 1-2, 2-3, 3-4, 4-5, 5-6의 5가지 상관관계가 관찰됩니다. 이 결과를 통해 다음과 같은 결론을 내릴 수 있습니다. ¹1번부터 6번까지의 수소 원자는 각각 인접한 구조를 가지고 있습니다. 또한, COSY 분석을 통해 인접한 원자들의 결합 정보를 이용하여 탄소 원자들 간의 연결 관계를 간접적으로 이해할 수 있습니다. ¹Hs. 이 정보는 하부 구조를 파악하는 데 매우 중요합니다.

하지만 그림 2와 같이 COSY 스펙트럼이 매우 복잡할 경우에는 어떻게 될까요?
녹색으로 표시된 영역을 보면 신호들이 겹쳐 상관관계를 파악하기 어렵다는 것을 알 수 있습니다. 이러한 상황에서는 구조 결정을 진행하는 것이 거의 불가능해 보입니다.

다당류나 고리형 분자와 같은 화합물의 경우, ¹그림 2에서처럼 H 신호가 좁은 범위에 밀집되어 나타나기 때문에 COSY에만 의존하면 구조 분석에 있어 막다른 길에 다다를 수 있습니다.

COSY가 상황을 적절하게 분석하지 못하는 경우에 대한 한 가지 해결책은 TOCSY입니다.
다음 절에서 TOCSY에 대해 설명하겠습니다.

TOCSY란 무엇인가요?

TOCSY(Total Correlation SpectroscopY)는 모든 것을 시각화할 수 있는 2D NMR 기술입니다. ¹동일한 스핀 네트워크에 속하는 수소 원자들을 동시에 관찰할 수 있습니다. 스핀 결합은 네트워크를 통해 전파되므로, TOCSY는 인접한 위치뿐만 아니라 전체 스핀 시스템에 걸친 상관관계를 보여주어 복잡한 유기 분자, 당류, 아미노산 등을 분석하는 데 매우 효과적입니다. TOCSY는 HOHAHA(HOmonuclear HArtmann-HAhn spectroscopy)라고도 불리며, 본질적으로 동일한 실험을 의미합니다.

예를 들어, 그림 3에 나타낸 것과 같은 원자 연결이 있다고 가정해 봅시다. H_A・H_B・H_C・H_D 인접한 원자들 사이의 스핀 결합을 통해 연결되어 있습니다. ¹Hs가 결합되어 있으며, 이러한 연결을 스핀 시스템(스핀 네트워크)이라고 합니다. 스핀 시스템은 H가 결합되지 않은 4차 탄소를 통해서는 전파되지 않습니다. ¹H는 산소를 통해 연결되어 있으므로 네트워크는 이 지점에서 끊어집니다. TOCSY는 직접적으로 연결되어 있지 않더라도 동일한 스핀 시스템 내의 핵들 사이의 상관관계를 관찰할 수 있게 해줍니다. 예를 들어, ¹H_A ¹H_DTOCSY에서 자화는 H에서 단계적으로 전달됩니다._A H로_B그다음 H에서_B H로_C그리고 마지막으로 H로부터_C H로_D다시 말해, 자화는 스핀 시스템을 통해 이동하면서 경로상의 모든 것을 연결합니다. 이러한 자화 전달을 "릴레이"라고 합니다. TOCSY는 이 릴레이를 기반으로 상관 신호를 관측합니다.

그림 4는 COSY와 TOCSY의 펄스 시퀀스를 보여줍니다. COSY는 두 개의 90° 펄스를 사용하는 반면, TOCSY에서는 두 번째 펄스가 스핀 록 펄스입니다. 이 스핀 록 펄스의 지속 시간을 "혼합 시간"이라고 하며, 이는 TOCSY에서 중요한 매개변수입니다. 혼합 시간을 증가시키면 스핀 시스템 내에서 더 먼 거리까지 전달된 상관 신호를 관찰할 수 있습니다.

TOCSY의 혼합 시간 및 상관 신호

그림 5는 두 개의 독립적인 스핀 네트워크를 가진 화합물의 TOCSY 스펙트럼의 개략도를 보여줍니다. 각 스핀 네트워크는 노란색과 녹색으로 표시됩니다. 그림에서 볼 수 있듯이, TOCSY는 모든 스핀 네트워크 간의 상관관계를 관찰합니다. ¹각 스핀 네트워크에 속하는 Hs 신호들입니다. 이때, 주 스펙트럼의 양쪽 축에서 "A"나 "a"와 같은 신호가 신호가 밀집되어 나타나는 영역에서 벗어나 나타나면, 해당 신호들은 노란색과 녹색 네트워크로 쉽게 구분되어 각 스핀 네트워크를 확인할 수 있습니다.

다음으로, 혼합 시간을 변화시켰을 때 A의 상관 신호가 어떻게 변하는지 살펴보겠습니다.
그림 6은 그림 5의 개략적인 TOCSY 다이어그램에서 A의 상관관계를 확대한 것이다.
혼합 시간이 짧으면 자화 ¹H_A 이웃으로만 이동합니다 ¹H_B그리고 상관 신호 B는 다음과 같습니다. ¹H_B 나타납니다.
혼합 시간을 더욱 증가시키면 자화는 다음 방향으로 이동합니다. ¹H_C그리고 상관 신호 C가 나타납니다. 혼합 시간을 더욱 증가시키면 자화는 이동합니다. ¹H_D그리고 상관 신호 D가 나타났습니다. 결과적으로, 연관성이 있다는 것이 분명해졌습니다. ¹H_A - ¹H_B - ¹H_C - ¹H_D.

혼합 시간이 길수록 자화가 이동할 수 있는 거리가 늘어납니다. 따라서 충분히 긴 혼합 시간을 사용하면 자화를 모든 영역으로 전달할 수 있습니다. ¹동일한 스핀 시스템 내의 Hs들을 통해 모든 상관 신호를 감지할 수 있습니다. ¹해당 스핀 시스템의 Hs.
또한, 서로 다른 혼합 시간으로 얻은 스펙트럼을 비교함으로써, 순차적인 순서는 다음과 같습니다. ¹H 연결도 알 수 있습니다.

2D TOCSY를 이용한 수크로오스 분석 예시

여기서는 2D TOCSY를 이용한 수크로오스 분석의 예를 제시합니다. 수크로오스는 글리코시드 결합으로 연결된 포도당과 과당으로 구성된 이당류입니다. 수크로오스는 총 22개의 아미노산을 포함합니다. ¹Hs이지만, 시료가 중수에 용해되어 있기 때문에 ¹수산화기(-OH)의 수소 원자는 중수소 교환으로 인해 관찰되지 않습니다. 따라서 이 경우 14입니다. ¹8을 제외하고 H가 관찰됩니다. ¹하이드록실기의 Hs.

그림 7에서 수크로오스의 COSY 스펙트럼을 보여드리겠습니다. 빨간색 테두리로 표시된 부분을 확대하여 그림 8에 나타냈습니다.

그림 7에서는 6개의 상관 신호를 비교적 쉽게 찾을 수 있습니다.
하지만 그림 8의 빨간색 원으로 표시된 것처럼 화학적 이동이 서로 가까운 영역에서 나타나는 신호 간의 상관관계를 해석하기는 어렵습니다. 많은 사람들이 분석 과정에서 이 부분에서 어려움을 겪을 수 있습니다.
따라서 TOCSY 방법을 사용해 보겠습니다.

그림 9. 혼합 시간을 20ms 및 150ms로 설정하여 측정한 TOCSY 스펙트럼

그림 9는 혼합 시간을 각각 20ms와 150ms로 설정하여 측정한 TOCSY 스펙트럼을 보여줍니다. 먼저, 상관 신호에 초점을 맞추겠습니다. ¹포도당의 아노머 위치에 있는 H는 다른 신호들과는 상당히 다른 화학적 이동에서 나타납니다. 앞서 그림 6에서 보여준 것처럼, 우리는 다양한 혼합 시간에 따른 상관 신호의 변화를 조사하여 전달 정보의 정확성을 확인할 것입니다. ¹아노머 위치에 H가 있습니다. 혼합 시간이 증가함에 따라 상관 신호가 더 많이 나타나는 것을 확인할 수 있습니다. 또한 신호가 겹치는 영역에서는 2D 스펙트럼보다 슬라이스된 데이터를 사용하는 것이 비교하기 더 쉽습니다. 따라서 X축을 따라 슬라이스를 추출하여 얻은 각 1D 스펙트럼(녹색 프레임으로 표시된 영역)을 비교하여 상관 신호를 확인합니다. ¹H.

그림 10의 맨 위쪽 스펙트럼은 기존의 것을 보여줍니다. ¹H 스펙트럼. 그 아래에는 혼합 시간을 20ms에서 200ms까지 변화시키면서 얻은 단면 데이터가 나와 있습니다. 왼쪽 신호는 Glu H-1에 해당하며, 이를 릴레이의 시작점으로 간주합니다. 혼합 시간이 20ms일 때는 인접한 Glu H-2와의 상관관계만 나타나며, 1번 위치와 2번 위치 사이의 연결만 확인할 수 있습니다. 혼합 시간이 증가함에 따라 상관관계 신호가 순차적으로 나타나고, 최종적으로 글루코스 부분의 1번 위치에서 6번 위치까지의 연결을 확인할 수 있습니다. COSY를 사용해서는 Glu H-5의 상관관계 상대를 명확하게 식별하기 어려웠지만, TOCSY를 사용하면 이 정보를 얻을 수 있었습니다.

다음으로, Fru H-3′에서 시작하는 릴레이를 살펴보겠습니다.
수크로오스 부분의 경우와 마찬가지로, 그림 11은 서로 다른 혼합 시간으로 얻은 TOCSY 스펙트럼을 보여줍니다.

그림 11. 혼합 시간을 20ms 및 150ms로 설정하여 측정한 TOCSY 스펙트럼

이전과 마찬가지로, 이번에는 Fru H-3′에 초점을 맞춰, 상당한 중첩이 없는 영역에 나타나는 신호에 대해 X축을 따라 잘린 데이터를 비교합니다.

그림 12의 맨 위 스펙트럼은 일반적인 ¹H 스펙트럼을 보여주고, 그 아래에는 서로 다른 혼합 시간으로 얻은 슬라이스 데이터가 있습니다.
이전과 마찬가지로 Fru H-3′을 릴레이의 시작점으로 삼습니다. 혼합 시간이 증가함에 따라 Fru H-4′, Fru H-5′, Fru H-6′과의 상관관계가 나타나며, 이를 통해 과당 부분 내의 연결을 확인할 수 있습니다.

이러한 방식으로 TOCSY는 여러 스핀 네트워크를 포함하는 화합물 내에서 스핀 네트워크를 분리할 수 있게 해줍니다. 혼합 시간을 변화시킴으로써 시작점으로부터의 거리도 평가할 수 있습니다. ¹H. COSY 스펙트럼이 복잡해지더라도 TOCSY를 사용하면 분자 구조를 결정하는 데 상당한 도움이 됩니다.

1D TOCSY를 이용한 포도당 분석 예시

1D TOCSY는 2D TOCSY의 1차원 버전이며 기본 원리는 동일합니다.
2D TOCSY는 분자 전체의 스핀 네트워크를 분석하는 데 사용되는 반면, 1D TOCSY는 특정 스핀이 속한 스핀 시스템만을 조사하려는 경우에 더 효과적입니다. ¹H는 속합니다. 1D TOCSY는 선택적으로 여기된 상태에서 자기화 전달, 즉 릴레이를 관찰합니다. ¹H. 혼합 시간을 점진적으로 증가시킴으로써 스핀 네트워크를 따라 자화 전달이 전파되는 것을 추적할 수 있습니다. 선택적 여기를 위해서는 다음을 선택하는 것이 가장 좋습니다. ¹화학적 이동이 다른 신호들과 충분히 분리된 H.
1D 측정의 또 다른 장점은 2D 측정에 비해 디지털 해상도가 더 높고 신호 중첩을 방지하기가 더 쉽다는 것입니다.

이제 포도당 분석의 예를 들어보겠습니다.

포도당은 수용액에서 α- 및 β-이성질체로 존재합니다. 따라서, ¹그림 13에서 볼 수 있듯이, 1H NMR 스펙트럼은 α-글루코스와 β-글루코스의 혼합 스펙트럼입니다. 선택적 여기를 위해서는 ¹H 신호의 경우 일반적으로 선택합니다. ¹H가 다른 것들보다 낮은 자기장에서 나타나는 경우(당류의 경우), ¹(아노머 위치의 H). 아노머 위치를 선택적으로 여기시켜 수행한 1차원 TOCSY 실험 결과 ¹그림 14에는 α-글루코스의 1번 위치에 있는 H가 나타나 있습니다.

혼합 시간을 20ms에서 200ms까지 변화시킴으로써 아노머 결합에서 시작하는 스핀 네트워크를 추적할 수 있었다. ¹α-글루코스의 1번 위치에 있는 H 원자를 중계점으로 사용했습니다. 혼합 시간 200ms의 하단 스펙트럼은 α-글루코스와 β-글루코스의 혼합 스펙트럼에서 α-글루코스의 스핀 네트워크만 추출한 결과를 나타냅니다. 또한, 앞서 설명했듯이 1D TOCSY는 2D 슬라이스 데이터보다 더 나은 디지털 해상도를 제공합니다.
따라서 1D TOCSY는 복잡한 스펙트럼에서 스핀 결합을 통해 연결된 스핀 시스템을 추출하고 확인하는 데 더 효과적입니다.
목적에 따라 1D TOCSY와 2D TOCSY를 적절히 사용하는 것이 좋습니다.

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2D에 의한 혼합 유기 불소 화합물의 분광 분리 ¹⁹F-¹⁹F TOCSY --1D를 추출하기 위해 ¹⁹각 화합물의 F NMR 스펙트럼--

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