극저온 전자현미경은 '급냉동' 상태에서 다양한 분자 구조를 조사하여 생명의 신비를 밝힙니다.
인터뷰 07
난바 케이이치
오사카 대학 프론티어 생명과학 연구과 교수.
단백질은 모든 살아있는 유기체를 구성하며 면역, 대사, 대뇌 기능 및 운동성과 같은 과다한 기능을 담당합니다. 오사카 대학 프론티어 생명과학 대학원 양성자 나노기계 그룹을 이끄는 케이이치 난바 교수는 이러한 기능의 기저에 있는 놀라운 메커니즘에 관심을 갖고 있으며 생물학적 분자의 3차원(XNUMXD) 구조를 연구하여 그 비밀을 밝히기 위해 적극적으로 노력하고 있습니다. .
구조에서 함수 이해하기
인체는 약 100,000가지 유형의 서로 다른 단백질로 구성되어 있습니다. 그들 각각은 신체 조직을 형성하고, 신진 대사를 촉매하고, 세포막을 통해 영양소를 교환하거나, 이물질을 파괴하는 것과 같은 독특한 역할을 합니다. 이러한 기능은 우리 몸의 중요한 활동 중 일부를 구성합니다.
Namba 교수는 "단백질은 생체 내에서 기능하는 일종의 나노머신입니다. 저는 그러한 나노머신이 어떤 역할을 하고 어떻게 작용하는지에 대해 엄청난 관심을 갖고 있습니다."라고 말했습니다. 40년 넘게 교수님. Namba는 구조에서 단백질 기능을 밝히는 연구에 참여했습니다.
단백질은 수백 또는 수천 개의 아미노산으로 구성된 선형 중합체입니다. 일부 특수 아미노산을 제외하고 단백질을 구성하는 아미노산은 20가지에 불과합니다. 따라서 서로 다른 서열에 있는 이들 아미노산의 서로 다른 조합은 100,000개의 서로 다른 종류의 단백질을 형성합니다. "선형 폴리머"라는 문구는 유연한 사슬의 이미지를 연상시킬 수 있습니다. 그러나 각각의 단백질이 뚜렷한 3차원 구조를 가지고 있다는 점에서 사슬과 구조가 완전히 다릅니다. 사실, 아미노산의 긴 사슬은 복잡한 구조로 접혀 있으며, 이러한 구조는 같은 종류의 단백질 사이에서 동일합니다. 구조는 정확히 같은 지점과 정확히 같은 각도로 접힙니다. 그러나 이러한 접힘은 때때로 다양할 수 있으며 흥미롭게도 동일한 분자 구조이지만 다른 3D 구조를 사용하면 완전히 다른 특성을 나타내고 뚜렷한 기능을 발휘할 수 있습니다. 예를 들어 2000년대 초반 식품업계를 공포에 떨게 한 BSE 문제의 원인은 바이러스도, 화학물질도 아닌 프리온이라는 단백질에 있다고 한다. 놀랍게도 프리온은 인간과 소의 두뇌에 고유합니다. 이 프리온은 3D 구조의 일부에서만 BSE를 유발하는 비정상적인 프리온과 다릅니다. 따라서 단백질의 기능을 규명하기 위해서는 분석 장비와 방법을 이용하여 단백질의 분자 구조를 이해할 뿐만 아니라 3차원 구조를 자세히 관찰할 필요가 있습니다.
정교한 생물학적 분자 모터
Namba 교수는 생물학적 분자의 3차원 구조 연구의 선구자 중 한 명입니다. 그는 분자 모터라고 불리는 단백질 그룹에 특히 관심이 있습니다. 사람이 만든 모터와 유사한 회전 또는 선형 운동을 나타내기 때문에 모터라고 합니다. 예를 들어, 인간의 근육은 주로 단백질인 액틴과 미오신이 필라멘트 형태로 조립된 근원섬유로 이루어지며, 이들 단백질 필라멘트의 선형 운동은 근육의 수축을 유발합니다. 인공 회전 모터와 더 유사한 것은 세균 편모 모터로, 이 모터는 편모라고 하는 긴 꼬리 모양의 나선형 필라멘트를 프로펠러로 회전시켜 점성 환경에서 세균 세포 운동성을 구동합니다. 대장균과 살모넬라에는 여러 편모가 있습니다. 나사처럼 추력을 생성하기 위해 번들로 제공됩니다. 그러나 분자 모터의 구조는 오랫동안 시각화하기 어려웠습니다.
난바 교수는 그 수수께끼에 사로잡혀 분자 모터의 3차원 구조를 밝히기 위한 일련의 연구를 시작했습니다. 편모 모터는 회전자, 고정자 및 부싱과 같은 하부 구조를 형성하는 약 30가지의 서로 다른 단백질로 구성되며 구조는 일반 전기 모터의 구조와 매우 유사합니다. 근육 섬유는 매우 고가의 육각형 격자를 형성하는 액틴 및 미오신 필라멘트의 서로 맞물린 다발로 만들어집니다. 산업용 모터는 인간의 가장 위대한 발명품 중 하나라고 하지만 위의 연구 결과는 이러한 개념이 오만한 가정일 수 있음을 시사합니다.
이러한 분자 모터의 조정된 운동에는 에너지가 필요합니다. 수소 이온이 세포막을 가로지르는 전기화학적 전위 구배에 의해 편모 운동의 고정자 채널을 통해 흐르고 액토미오신에 의한 ATP 가수분해가 근육 수축의 에너지원이라는 것은 알려져 있었지만, 그들의 높은 에너지 효율은 수수께끼였습니다. 열적 브라운 운동의 에너지가 관련될 수 있다는 주장이 있었지만, 어떻게 사용되는지에 대한 메커니즘은 알려지지 않았습니다. 열원은 원자 및 분자 변동에 에너지를 제공하지만 물체를 원자 수준에서 고려할 때 원자와 분자는 임의의 속도로 임의의 방향으로 이동합니다.
분자 모터조차도 분자와 원자의 열에 의한 무작위 운동을 통해 특정 방향으로 추력을 생성할 수 없다고 생각되었습니다. 그러나 그들은 실제로 한 방향으로 움직입니다. 따라서 임의의 움직임을 수정하는 메커니즘이 있습니다.
최근 난바 교수가 그 해답에 한걸음 더 다가섰다. 그는 근육 섬유의 액토미오신이 한 방향으로는 선호되는 움직임을 허용하지만 다른 방향으로는 허용하지 않는 래칫처럼 구조화되어 있음을 발견했습니다. 이러한 정교한 시스템은 뚜렷하게 비대칭적이고 역동적인 3D 구조를 가진 단백질 분자로 구성됩니다.
개척자로서의 극저온 현미경
난바 교수 연구실에 있는 JEOL의 저온 전자 현미경 "CRYO ARM™"
앞서 언급한 발견은 단백질과 그 복합체의 3차원 구조를 자세히 영상화함으로써 가능했다. X선 결정학에 의한 구조 분석은 단백질 구조를 결정하는 주요 방법이었습니다. 이 방법에서는 결정화된 단백질 시료에 X선 빔을 조사하여 회절 빔의 강도를 측정합니다. X선 단백질 결정학은 1950년대부터 존재했으며 알려진 단백질 구조의 90%가 이 방법을 사용하여 해결되었습니다.
그러나 이 방법은 결정화가 분석의 전제 조건이지만 쉽지 않다는 큰 단점이 있습니다. 또한 결정화는 단백질 구조를 가장 안정적인 구조로 고정시키는 경향이 있습니다. 분자 모터는 기능을 수행하는 동안 구조가 크게 변경되지만 안정적인 상태에서만 결정화될 수 있습니다. 즉, 다양한 3차원 구조를 관찰할 수 없습니다.
이러한 단점을 극복하기 위한 방법으로 극저온 전자현미경이 주목받고 있다. 극저온 전자 현미경에는 "극저온 단계"라는 샘플 단계가 장착되어 있어 샘플 그리드 온도를 -160°C ~ -270°C 사이의 초저온으로 유지할 수 있습니다. 구멍이 있는 탄소 격자에 있는 용액의 박막에 있는 단백질 분자는 "살아있는" 상태 형태를 보존하기 위해 액체 에탄을 사용하여 즉시 동결됩니다. 극저온 전자 현미경을 사용하여 여러 방향에서 투영 이미지를 기록하면 기능의 정확한 순간에 캡처된 이러한 단백질의 3D 구조가 가능합니다. 또한 소량의 샘플 용액만 동결하면 되며 여러 결정화 조건을 탐색할 필요가 없습니다.
난바 교수는 20년 넘게 극저온전자현미경을 연구하며 극저온전자현미경을 이용한 분석법 개발을 추진해 왔다. 근육 섬유에서 액토미오신 기능의 메커니즘을 식별하는 것은 저온 전자 현미경으로 가능한 한 성과입니다. 난바 교수의 오랜 염원인 편모 모터의 3차원 구조를 자세히 밝히는 것은 더 이상 꿈이 아니다.
"왜 단백질과 같은 작은 물질의 작용이 근육의 가시적인 움직임으로 이어지는가? 학창 시절에 이 연구 분야에 입문하게 된 질문입니다. 그런 시절이 있었다"고 난바 교수는 말했다.
세계 최고의 현미경
별도의 방에서 CRYO ARM™을 조작하는 Kato 교수(왼쪽)와 Namba 교수
Cryo-electron microscopy는 전자의 불충분한 분해능으로 인해 X-ray 구조 분석보다 오래 뒤쳐져 왔습니다. 전자현미경은 시료에 강한 전자빔을 조사하여 시료에 전자를 산란시키고 렌즈는 전자의 산란에 따라 시료의 상을 생성한다. 그러나 생물학적 분자는 전자빔에 의해 쉽게 손상되기 때문에 방사선 손상을 피하기 위해 저선량 기술을 사용하여 빔 강도를 크게 감쇠시켜야 합니다. 우리는 어두운 방에 작은 전구만 있을 때처럼 흐릿하고 시끄러운 이미지만 볼 수 있습니다.
그러나 기술 개발에 대한 오랜 노력이 이제 이 문제를 극복하는 데 도움이 되었습니다. 하드웨어 측면에서 카메라는 상당한 개선을 거쳤습니다. 기존의 CCD 카메라는 산란된 전자를 빛으로 변환하여 이미지를 생성하고 이 과정에서 다양한 노이즈가 발생하여 증폭됩니다. 따라서 탐지 성능을 향상시킬 수 없습니다. 그러나 전자를 직접 감지하여 이미지를 기록할 수 있는 CMOS 카메라의 등장으로 감도와 해상도가 모두 향상되었으며 고속 프레임 레이트 이미징으로 표본의 움직임을 보정할 수 있게 되었습니다. 따라서 이러한 카메라를 사용하면 크게 향상된 이미지 품질을 얻을 수 있습니다.
이미지 처리 소프트웨어도 눈에 띄게 발전했습니다. 최신 소프트웨어를 사용하면 모든 다른 방향의 단백질 분자에 대한 수십만 개의 투영 이미지를 저온 현미경으로 쉽게 얻을 수 있습니다. 이러한 투영은 각 그룹에 정확히 동일한 방향의 투영이 포함된 그룹으로 분류됩니다. 이제 동일한 클래스의 이미지를 중첩하여 신호 대 잡음비를 개선할 수 있으므로 고해상도 세부 사항을 관찰할 수 있습니다. 마지막 단계에서 많은 클래스 평균이 3D 구조로 병합됩니다. 이러한 복잡한 데이터 처리는 현대 컴퓨터의 고급 처리 능력으로 인해 실험실 수준에서 가능합니다.
Namba 교수의 연구실에 소개된 CRYO ARM™은 "세계 최고의 현미경"에 대한 그의 요구 사항을 충족하도록 설계되었습니다. 설계 목표는 표준 X선 결정학보다 우수한 2.0Å(1Å 또는 옹스트롬은 0.1nm에 해당)보다 나은 분해능에서 구조 분석을 가능하게 하는 것이었습니다. 또한 여러 샘플 그리드를 CRYOARM™에 로드할 수 있으며 사용자의 편의를 위해 언제든지 시편 스테이지로 자동 교환할 수 있습니다. 이미지 데이터 수집 및 분석에 필요한 시간의 대폭적인 단축은 이 현미경의 가장 큰 장점 중 하나입니다. 3~5년 전만 해도 6년이 걸리던 XNUMX차원 구조해석을 이제 일주일이면 끝낼 수 있다.
모퉁이를 돌면 돌파구
난바 교수는 단백질뿐 아니라 지질, 핵산 등 다른 생체분자 복합체의 3차원 구조가 5년 안에 가시화될 것으로 내다봤다.
특히 중요한 응용 분야는 세포 표면의 막 단백질 분석입니다. 이러한 단백질은 약제의 작용 표적이며, 3차원 구조 분석을 통해 분자 기능의 기본 메커니즘을 밝히고 치료 결과를 획기적으로 개선하며 부작용이 없는 약물 개발을 가능하게 할 것입니다.
미래에는 최소한의 전원을 필요로 하고 주변 열을 XNUMX차 에너지원으로 사용하는 슈퍼 에너지 절약 기계와 같은 생물학적 분자 모터의 산업적 응용을 향한 움직임이 있을 수도 있습니다. 이 역설적인 개념은 기계와 공학에 대한 오랜 믿음을 무시할 수 있습니다.
우리가 그러한 발명을 실현하려면 아직 멀었지만, 그들의 실현은 바로 모퉁이에 놓여 있음이 증명될 수 있습니다.
β-갈락토시다제 2.6 Å 분해능 CRYO ARM™
샘플 :
PETG와 β-갈락토시다제현미경:
CRYO ARM™(Schottky 200kV) / K2 서밋이미지 수:
JADAS에서 2,500일 동안 3건이미지 픽셀 크기:
0.8Å/픽셀입자 이미지 수:
350,000(초기 픽업), 88,564(최종 3D 재구성용)소프트웨어:
Motioncor2, Gctf, Gautomatch, Relion2.0총 복용량:
70e-/Å2(70프레임(0.2초/프레임 x 14초)
데이터: 오사카 대학 Dr. T. Kato 및 Dr. K. Namba 제공, 2017년 XNUMX월
난바 케이이치
오사카 대학 프론티어 생명과학 연구과 교수.
오사카대학 공학대학원 박사과정 수료 후 일본과학진흥회 연구위원, 미국 1992개 대학의 연구원, 일본 연구개발공사 그룹장 등을 역임했다. 일본(현 일본 과학 기술청). 그 후 2002년 마쓰시타전기공업(주) 국제고등연구소 연구국장을 역임했습니다. XNUMX년부터 현재의 자리에 있습니다. 그는 생물물리학 및 분석 분야를 전문으로 하고 있습니다. 분자 모터와 같은 생체 분자 복합체의 구조와 기능.
게시일: 2017년 XNUMX월