단백질 3D 구조의 초고속 분석
— 극저온 전자현미경용 시료 준비 10분 소요 —

인터뷰 15

이노우에 츠요시
생체분자 구조 및 기능 분석 연구실
오사카대학교 약학대학원

단백질과 같은 생체 분자의 3차원 구조는 생화학 및 신약 개발 연구에 필수적인 정보가 되고 있습니다. 극저온 전자현미경(cryo-EM)을 이용한 분석법은 이미 널리 사용되고 있지만, 분석 속도를 획기적으로 향상시킬 수 있는 도구인 "EG-grid™"가 이노우에 교수에 의해 개발되었습니다. 본 인터뷰에서는 이노우에 교수와 EG-grid™의 특징에 대해 이야기를 나누었습니다.

극저온 전자현미경의 빠른 침투

단백질의 3차원 구조 분석 방법으로 극저온 전자 현미경(cryo-EM)이 빠르게 확산되고 있다. 국제 공공 데이터베이스인 PDB(단백질 데이터 뱅크)에는 새롭게 규명된 생체 분자(단백질, 핵산 등)의 3차원 구조 데이터가 매일 등록되고 있다. 해당 데이터는 관련 논문이 발표되는 즉시 공개된다. 공개된 구조 데이터 중 전자 현미경으로 규명된 데이터는 2024년 한 해 동안 5,791건에 달해 전체 공개 데이터의 37%를 차지했다.

그래프에 따르면 전자현미경을 이용한 데이터는 2017년경부터 증가하기 시작했습니다.
올해, 극저온 전자 현미경의 핵심 기술을 개발한 세 명의 연구자가 노벨 화학상을 수상했습니다. 오사카대학교 약학대학원 이노우에 츠요시 교수는 "노벨상 수상을 계기로 극저온 전자 현미경과 그 방법에 대한 인식이 높아지고 활용이 가속화되었다"고 말합니다.
극저온 전자현미경(cryo-EM)이 인기를 얻는 이유는 기존 X선 결정 구조 분석에서 필수적이었던 단백질 결정화 과정이 필요 없기 때문입니다. X선 결정 구조 분석은 3차원 구조를 규명하는 주요 방법이지만, 이 방법에서는 단백질을 약 100μm 크기의 큰 결정으로 만들어야 합니다. 시료 준비에 수개월 이상이 소요되며, 결정화가 어려운 단백질이나 복합체도 존재합니다. 극저온 전자현미경은 결정화가 어려운 단백질도 분석할 수 있다는 장점을 가지고 있습니다.
게다가, 시료량이 적더라도 분석이 가능하다는 점이 또 다른 큰 장점입니다. 정제가 어려운 단백질이나 불안정하고 쉽게 응집되는 복합체와 같은 까다로운 구조 분석도 이 시스템을 통해 손쉽게 수행할 수 있습니다.

극저온 전자현미경 분석을 위한 시료 준비에도 한 달이 걸립니다.

그렇다면 극저온 전자현미경 촬영에는 어떤 전처리 과정이 필요할까요? 네, 필요합니다. 초기 단계에서는 시료 준비와 전자현미경 사진 촬영에 시간이 다소 걸렸습니다.

3차원 구조 분석에는 단일 입자 분석법이 사용됩니다. 이 방법에서는 극저온 전자 현미경(cryo-EM)을 이용하여 개별 단일 입자의 이미지를 여러 장 촬영합니다. 정확도를 높이기 위해 다양한 각도에서 촬영한 여러 이미지를 준비하고, 이를 컴퓨터를 이용하여 3차원 구조로 재구성합니다. 이를 위해서는 효율적인 이미지 획득이 가능한 적절한 시료를 준비해야 하며, 이를 통해 연구 속도를 향상시킬 수 있습니다.

시료 준비에는 전통적으로 얼음 매립법이 사용되었습니다. 이 방법은 용액을 급속 냉동시켜 단백질을 비정질 얼음 내에 매립하는 방식입니다. 그러나 이 방법은 농도 조절에 어려움이 있었습니다. 농도가 너무 높으면 입자가 겹쳐 유용한 이미지를 얻을 수 없고, 반대로 농도가 너무 낮으면 입자 수가 줄어들어 이미징 효율이 저하됩니다. 또한, 얼음이 두껍고 단백질 입자가 두께 방향으로 분포하면 초점을 맞출 수 있는 입자 수가 제한되어 이미징 효율이 더욱 떨어집니다.

"농도를 조절하는 것은 어려운 일입니다. 하지만 얼음 포매법에서 가장 중요한 문제는 단백질들이 같은 방향으로 정렬되도록 하는 최적의 배향성을 확보하는 것입니다!" (이노우에 교수)

바람직한 배향은 동결 과정 중에 형성됩니다. 하지만 어떤 경우에는 동결 전에 동일한 방향으로 배향이 이루어지기도 합니다. 이는 고도로 소수성인 단백질이 기체-액체 계면에 부착되어 동일한 방향으로 배향되는 경우입니다. 기존의 시료 준비 방법으로는 이러한 조건을 고려하는 데 한 달 정도 소요될 수 있습니다.

이노우에 교수 연구팀은 이러한 문제들을 해결하는 훌륭한 도구인 "EG-grid™(에폭시화 그래핀 그리드)"를 개발하는 데 성공했습니다. EG-grid™는 에폭시기를 함유한 그래핀으로 만들어진 지지체입니다. 에폭시기는 단백질 입자 표면에 존재하는 라이신 잔기를 포획하는 성질을 가지고 있어 단백질 입자가 다양한 각도로 부착됩니다. 에폭시기 밀도가 적절하게 미리 설정되어 있으므로 용액 농도 조절에 대해 걱정할 필요가 없습니다. 두께 방향으로의 분포가 없어 이미징 시 초점을 정확하게 맞출 수 있습니다.

EG-grid™를 사용하면 이전에는 거의 한 달이 걸리던 시료 준비 시간이 약 10~15분으로 단축됩니다. 동결 과정을 포함하더라도 20분 이내에 시료를 극저온 전자 현미경에 장착할 수 있습니다.

이미징 효율 또한 향상되었습니다. 단일 촬영으로 얻을 수 있는 유효 입자 수가 얼음 매립법에 비해 증가하여 필요한 이미지 수가 줄어들었습니다. 일부 단백질의 경우, 기존 이미지 수의 1/10 또는 1/20 정도만으로도 분석을 완료할 수 있습니다.

"정체불명의 소독제/탈취제"로 인해 개발이 촉발되었습니다.

EG-grid™의 개발은 "정체불명의 소독제/탈취제"와의 만남에서 시작되었습니다.

2015년, 오사카 대학에 한 문의가 들어왔습니다. "말기 구강암 환자가 이 소독제/탈취제를 냄새 제거용으로 사용했더니 암이 퇴행하는 것처럼 보였습니다. 그 기저 메커니즘을 조사해 주시겠습니까? 만약 효과가 실제로 있다면 항암제로 개발하고 싶습니다." 이와 함께 "신비한 물" 한 병이 전달되었습니다.
우리는 "재료가 무엇인가요?"라고 물었지만, 돌아온 대답은 "그것은 공개할 수 없습니다."뿐이었습니다.
다소 미심쩍게 들렸습니다. 그러나 당시 공학대학원 교수였던 후쿠즈미 슌이치 교수에게 분석을 맡기자, 라디칼 전문가인 그는 주성분과 그 기저 메커니즘을 신속하게 밝혀냈습니다.

주요 성분은 아염소산 이온(ClO₄²⁻)이었다.₂-). 이 이온(ClO)인 것으로 밝혀졌습니다.₂-) 반응성 이산화염소(ClO₂)를 생성합니다.₂표적 박테리아와 바이러스가 존재할 때 필요한 만큼만 물에 용해시키는 것이 그 메커니즘이었습니다.

이후 오사카 대학은 이처럼 매우 안전한 "물"을 MA-T(Matching Transformation System)라고 명명하기로 결정했습니다. 이는 염소계 가스를 발생시킬 수 있는 다른 물질과의 혼동을 피하기 위한 것입니다.

후쿠즈미 교수와 같은 연구 그룹에서 분석을 담당했던 오쿠보 특별교수(당시)는 광화학 전문가였다. 그는 "이 물질에 빛을 비추면 어떻게 될까?"라는 의문을 품게 되었다. 산성 조건에서 이산화염소를 기체로 발생시킨 후 빛에 노출시키자, 이산화염소가 반응성 산소종과 염소 라디칼로 분해되는 것을 관찰했다. 나아가, 이러한 반응성 산소종과 염소 라디칼을 이용하여 다양한 물질을 산화시킬 수 있다는 사실을 발견했다.

예를 들어, 메탄을 산화시키면 메탄올과 포름산이 생성됩니다. 이 과정에서 이산화탄소는 배출되지 않습니다. 또한, 상온·상압 조건에서 메탄올을 합성한 것은 세계 최초입니다. 메탄은 소똥 발효나 석유·천연가스 채집 현장에서 얻을 수 있지만 운송이 어렵습니다. 그러나 메탄을 액체 메탄올과 포름산으로 전환하면 운송이 용이해지고 활용 범위가 확대됩니다.

EG-grid™는 이러한 산화 반응을 극저온 전자현미경(cryo-EM)에 활용한 결과물입니다. 그래핀 표면이 산화되어 하이드록실기(-OH)가 생성되면, 단백질을 고정화할 수 있는 기능성 그룹으로 치환할 수 있습니다. 이러한 아이디어를 바탕으로 EG-grid™가 개발되었습니다.
이노우에 교수는 새롭게 발견된 산화 반응과 높은 안전성을 지닌 MA-T가 다양한 분야에 적용될 수 있을 것이라고 생각하고, 실용화 연구를 위해 일본 과학기술진흥기구(JST)의 기업, 연구기관, 학계 간 개방형 혁신 플랫폼 프로그램인 OPERA에 지원서를 제출했습니다. 하지만 지원서가 채택되려면 상당한 규모의 공동 연구 자금이 필요했고, 마감일은 3개월도 채 남지 않았습니다. 그의 간절한 요청에 응답한 기업 중 하나가 바로 전올(JEOL Ltd.)이었습니다.

JEOL은 2018년에 "오사카대학교-JEOL 요코구시 연구 연합 연구소"를 설립했으며, 연구 자금은 이 연구소에서 지원되었습니다. 이노우에 교수의 제안은 OPERA 프로젝트(2019년 10월부터 2024년 3월까지)에 대한 연구 과제로 채택되었습니다.
이를 통해 EG-grid™ 개발이 가능해지고 JEOL이 프로젝트를 지원할 수 있게 됩니다. 크라이오 암™ 200 그것은 같은 시기에 연구실에 설치되었습니다.

이 OPERA 프로젝트는 많은 성과를 거두었고 높은 평가를 받았습니다. 2024년 2월에는 제6회 총리상을 수상했습니다.^th 일본 오픈 이노베이션상 수상. 메탄 산화 연구는 2024년 4월 문부과학성 장관 표창을 받았습니다. 또한, 일본 과학위원회가 제안한 "기후 위기 해결을 위한 산업, 정부, 학계, 그리고 시민의 공동 역량"(2025년 10월 발표)에도 그들의 노력이 반영되었습니다.

다수의 특허를 획득했으며, 여러 기업의 특허 활용 요구에 힘입어 일본 MA-T 산업협회가 설립되었습니다(2020년 11월). 현재 회원사는 91개, 후원 회원사는 22개 기업/단체에 달합니다(2025년 1월 기준). MA-T는 간사이 오사카에서 개최된 엑스포 2025의 "오사카 헬스케어 파빌리온"에 부스를 설치하고 인체 및 반려동물용 구강 관리 제품과 공간 분사형 환경 관리 제품을 전시하여 MA-T의 높은 안전성 잠재력을 보여주었습니다.

극저온 전자현미경(Cryo-EM) 적용 범위가 더욱 확대됩니다.

현재 EG-grid™의 자매 제품인 에폭시 그룹 대신 다른 기능기를 가진 제품들이 검토 중입니다. 산 염화물(염소 화합물)이 부착되면 에폭시 그룹보다 단백질(아미노기 및 티올기)과 더 빠르게 결합합니다. 하지만 취급이 어려워 전 세계적인 판매가 불가능합니다. "히스티딘 태그로 단백질을 고정화할 수 있을까요?"라는 질문에 대한 답변으로 이미 여러 프로토타입이 개발되었습니다. 그러나 모든 단백질이 같은 방향으로 정렬된다는 단점이 있습니다. "그럼에도 불구하고, 선호하는 방향과 다른 각도에서 이미지를 촬영할 수 있으므로 임시방편으로 사용할 수 있습니다." (이노우에 교수)

극저온 전자현미경과 단일 입자 분석을 결합한 방법의 약점을 꼽자면, 작은 단백질 분석에는 적합하지 않다는 점입니다. 과거에는 100,000 Da(*) 이상이어야 한다고 여겨졌지만, 현재는 50,000~60,000 Da 크기의 단백질 분석도 가능해졌습니다. 극저온 전자현미경을 이용한 3D 구조 분석의 범위가 점차 확대되고 있는 것입니다.

*달톤(Da): 탄소-12 원자 질량의 1/12에 해당하는 질량 단위.

"X선 결정 구조 분석이 유일한 선택지였던 시절에는 이 단백질이 결정을 형성할 수 있을지, 그리고 형성된다면 언제쯤 형성될지 걱정이 많았습니다." (이노우에 교수) 이제 극저온 전자현미경(cryo-EM)이 가장 먼저 떠오르는 분석법으로, 특정 질량의 단백질을 즉시 분석할 수 있게 되었습니다.

현재 EG-grid™에 대한 수요가 급증하고 있습니다.