결정 구조 분석을 위한 최고의 도구인 MicroED를 더욱 쉽게 사용할 수 있도록 개선했습니다!

인터뷰 16

나루히코 아다치
준 교수
생존 역학 생명 과학 센터
츠쿠바 첨단 연구 연합(TARA)
쓰쿠바 대학

싱크로트론 X선으로도 분석할 수 없을 정도로 작은 1µm 미만의 결정 구조를 규명하는 방법이 2013년부터 2015년 사이에 여러 연구자들에 의해 제안되었습니다. 이 방법은 전자 회절 데이터를 이용하는 것으로, 극저온 전자 현미경(cryo-EM)을 사용하는 마이크로 전자 회절(MicroED) 방법입니다. 이 획기적인 기술을 통해 미량 및 다형성 결정이 존재하는 시료의 화학 구조를 처음으로 관찰할 수 있게 되었습니다. 쓰쿠바 첨단 연구 연합(TARA)의 생존 역학 생명 과학 센터의 아다치 나루히코 부교수는 극저온 전자 현미경을 MicroED 전용 장비로 활용하는 방안을 적극적으로 추진하는 한편, 전자 회절 워크플로우를 구축하기 위해 노력하고 있습니다.

TARA에 MicroED 전용 장비가 설치되었습니다!

2018년, 유전자 발현 조절 연구를 진행해 온 아다치 나루히코 조교수가 소속된 고에너지 가속기 연구기구(KEK)에 극저온 전자현미경(cryo-EM)이 도입되었다. 다른 기관에서 cryo-EM을 사용해 본 경험이 있었던 아다치 박사는 이 장비의 관리를 맡게 되었다. 그는 워크플로우 매뉴얼을 제작하여 단일 입자 분석의 활용 범위를 넓히는 데 힘썼다. 2019년부터는 MicroED 연구에도 착수하여 KEK의 X선 결정 구조 분석 전문가인 야마다 유스케 조교수와 협력하여 MicroED 실험을 도입하려 시도했다. 이후 2023년, 아다치 박사는 두 대의 cryo-EM(JEOL사 제작 CRYO ARM™ 300 II 및 CRYO ARM™ 200)이 설치된 TARA에 부교수로 부임하여 MicroED 실험을 도입하고 측정 실험을 꾸준히 축적해 왔다.

"제가 2023년에 TARA에 합류했을 당시, 이와사키 박사님과 하라다 박사님은 이미 CRYO ARM™ 300 II를 사용하여 단일 입자 분석을 진행하고 계셨습니다. 같은 시기에 설치된 CRYO ARM™ 200은 저희가 전용 MicroED 장비로 사용할 수 있도록 제공되었습니다."

전용 기기를 이용한 매끄러운 MicroED 측정

TARA의 MicroED는 두 가지 뚜렷한 특징을 가지고 있습니다.
첫째, CRYO ARM 200은 MicroED 전용 장비로 운영됩니다. 단일 입자 분석과 MicroED 측정을 위해 하나의 극저온 전자현미경을 사용할 수는 있지만, 두 측정 방법을 전환할 때마다 측정 조건을 재설정해야 합니다. 단일 입자 분석과 MicroED는 서로 다른 전자선량 조건을 요구하기 때문에 전환에 상당한 시간이 소요됩니다. 그러나 TARA에서는 CRYO ARM 200을 설치 이후 MicroED 전용 장비로 운영해 왔기 때문에 원활하고 효율적인 작동이 가능합니다. MicroED 전용으로 공유 및 운영되는 극저온 전자현미경은 전 세계적으로도 드뭅니다. 이러한 장비의 존재는 매우 귀중하며 TARA의 주요 강점 중 하나입니다.
"설비 운영 관점에서 볼 때, 극저온 전자현미경(cryo-EM) 장비는 주로 단일 입자 분석을 위해 관리되는 경우가 많으며, 이는 여전히 가장 지배적인 측정 기술입니다. 따라서 미세전자현미경 분석(MicroED) 전용으로 운용되는 cryo-EM 장비는 매우 드뭅니다. 그러므로 CRYO ARM 200을 MicroED 전용 장비로 운영할 수 있다는 것은 편의성과 운영 안정성 측면에서 매우 중요한 의미를 갖습니다."

사용 편의성의 핵심 - 자동화된 워크플로

두 번째 특징은 "사용 편의성"입니다.
극미세하고 미량이며 다형성인 결정 구조를 분석할 수 있는 마이크로전자현미경(MicroED)에 대한 수요는 분명히 존재합니다. 하지만 워크플로우와 소프트웨어가 이미 잘 정립된 단일 입자 분석처럼 간단하지는 않습니다. 그럼에도 불구하고, 타라 연구소의 아다치 부교수는 매년 약 40개 연구 그룹의 마이크로전자현미경 측정 요청을 처리하고 있습니다. 이러한 현상의 비결은 무엇일까요?

"저희가 운영하는 극저온 전자현미경(cryo-EM)은 공동 시설이므로 외부 사용자도 쉽게 이용할 수 있어야 합니다. 대부분의 외부 사용자는 한두 달에 한 번 정도만 이용하기 때문에 최대한 사용자 친화적이어야 합니다. 이를 위해 가능한 한 자동화된 워크플로우를 구축하고 포괄적인 매뉴얼을 준비하는 것이 필요하다고 판단했습니다. 하지만 한 기관의 구성원만으로는 모든 것을 해낼 수 없기에, 여러 기관이 협력할 수 있도록 MicroED 온라인 커뮤니티를 만들었습니다. 오사카 대학의 마키노 박사, 도쿄 대학의 야나기사와 박사, 오사카 대학의 나카네 박사의 도움을 받아 자동화 소프트웨어를 도입했습니다. 측정 데이터 처리는 오사카 대학의 나카네 박사 등의 도움을 받아 도호쿠 대학의 야마다 박사가 준비했습니다. 자동 측정 및 데이터 처리 분석 시스템이 완성되자, TARA의 전용 장비와 함께 반복적으로 사용하며 완성도를 높였고, 동시에 매뉴얼 제작에도 힘썼습니다."
이러한 방식으로 측정 및 데이터 처리 자동화와 매뉴얼 제작을 완료할 수 있었고, 그 결과 TARA의 MicroED는 외부 사용자들도 쉽게 사용할 수 있게 되었습니다.

TARA의 MicroED 과정은 고학년 학부생에게도 충분히 쉬울까요!?

이러한 노력 덕분에, TARA의 자동화된 MicroED 워크플로우를 따르면 학생들도 하룻밤에 약 200개, 주말 동안 1000개 정도의 입자를 측정할 수 있습니다. 어류의 구아닌 결정 분석 실험에서는 학부 4학년 학생들이 일주일 만에 약 2000개의 입자를 측정하기도 했습니다. 학부 4학년 학생들이 극저온 전자현미경(cryo-EM) 장비와 함께 MicroED 장비를 완벽하게 활용하는 것은 전 세계적으로도 드문 사례입니다. 이는 자동화된 측정 및 데이터 처리가 워크플로우에 통합되어 안정적이고 신뢰할 수 있는 작동이 가능하기 때문입니다.

구아닌 결정 측정 결과와 MicroED 워크플로 자동화 결과를 종합하여 독창적인 논문으로 제출할 예정입니다.

"물고기 비늘이 은색이나 푸른색으로 빛나는 것은 생선 피부에 구아닌 결정이 존재하기 때문이라는 것은 이미 알려진 사실입니다. 하지만 이 구아닌이 α형인지 β형인지는 알려지지 않았습니다. 비늘 속 구아닌 결정은 너무 작아서 X선 회절을 이용한 결정 구조 분석이 불가능했기 때문입니다. 2024년 연어의 구아닌 구조가 β형이라는 사실이 밝혀지면서, 다른 어종에도 β형 구아닌, α형 구아닌, 또는 β형과 α형이 혼합된 다형성 결정이 존재하는지 의문이 생겼습니다. 이에 우리는 학부 고학년 학생들과 함께 꽁치, 칼치, 자리돔의 비늘 뿌리 부분 세포 구조를 조사하기로 했습니다. 마이크로ED는 시료 내 개별 결정을 관찰할 수 있기 때문에 β형과 α형이 혼합된 다형성 결정이라도 정확하게 분석할 수 있습니다. 다만, 세포에서 결정을 채취할 경우 결정이 손상될 수 있다는 단점이 있습니다. 혹은 생선 살과 섞여 있기도 합니다. 불확실한 입자들을 수없이 측정하지 않으면 목표 결정체를 찾기가 매우 어렵습니다. 약 2000개의 입자를 측정한 결과, β형과 α형 구아닌 결정체의 존재를 모두 확인할 수 있었습니다. 이는 우수한 학생들의 열정과 첨단 측정 및 데이터 처리 자동화 덕분이라고 생각합니다.
덧붙여 말씀드리자면, 저는 학생들에게 실험용 생선을 직접 구해오도록 했습니다. 생선이 신선도를 잃으면 결정체도 약해지거든요. 그래서 학생들은 이제 "싱싱하고 싱싱한 꽁치"를 구별하는 능력을 키웠을 거라고 확신합니다. (웃음)

MicroED는 다른 분석 방법의 한계를 보완합니다.

마이크로ED는 미량 및 다형성 결정으로 구성된 시료에서 1µm 미만의 미세한 결정에 대해서도 회절 데이터를 얻을 수 있습니다. 그러나 목표 결정의 존재 여부가 불확실한 다양한 입자의 혼합물이 포함된 시료를 측정하는 것은 어렵습니다. 마이크로ED만으로는 관찰해야 할 입자의 수(100개 또는 1,000개)를 정확히 판단하기 어렵습니다. 이러한 경우, 분말 X선 회절을 이용하여 시료에 목표 결정이 존재하는지 확인한 후, 마이크로ED로 구조를 분석하는 것이 효과적입니다.
또한, 마이크로전자현미경(MicroED)으로 측정한 데이터는 분자의 구조(형태)는 보여주지만 구성 원소의 종류는 식별하지 못합니다. 마이크로전자현미경만으로는 완전히 알려지지 않은 물질의 구조를 분석할 수 없습니다. 구조식과 원소 조성이 알려져 있다면 이를 바탕으로 각 원자를 식별할 수 있습니다. 따라서 질량 분석법 및 핵자기 공명(NMR)과의 병용이 유용합니다. 이처럼 마이크로전자현미경을 이용하여 분자 구조를 규명하기 위해서는 다른 분석 방법과의 결합이 중요합니다.

"한 연구팀은 분말 X선 결정학을 이용해 극미량의 미세 결정 형태로만 존재하는 화합물의 구조를 규명하기 위해 오랫동안 노력해 왔습니다. 하지만 2년이 지나도 어떤 구조도 밝혀내지 못했습니다. 결정 품질을 개선하는 데 모든 시간을 쏟았음에도 불구하고, 분말 X선 결정학만으로는 구조를 규명할 수 없었던 것입니다. 결국 그들은 TARA에서 마이크로전자현미경(MicroED)을 사용해 보았고, 단 일주일 만에 10개의 결정 구조를 밝혀내는 데 성공했습니다! 연구팀 전체가 축제 분위기에 휩싸였습니다(웃음). 이와 비슷한 경험이 여러 번 있었습니다. 마이크로전자현미경으로 미세 결정 시료를 측정하니 구조가 한꺼번에 밝혀졌습니다. 이는 분말 X선 결정학과 마이크로전자현미경의 조합이 얼마나 큰 효과를 낼 수 있는지 보여주는 훌륭한 사례입니다. 처음에는 결정성이 좋지 않더라도 분말 X선 결정학에서 목표 결정이 존재한다는 것이 확인되면 결정 품질을 점진적으로 개선할 수 있습니다. 그런 다음 마이크로전자현미경을 사용하여 각각의 미세 결정을 하나씩 분석할 수 있습니다. 저는 이러한 워크플로우가 매우 적합하다고 생각합니다." MicroED로."

MicroED는 획기적인 강점을 지니고 있지만, 완전히 알려지지 않은 물질을 분석하는 데에는 한계가 있습니다. 이러한 점에서 MicroED는 기존 3차원 구조 분석 방법의 한계를 보완하는 기술이라고 할 수 있습니다. 그 활용도를 극대화하기 위해서는 분말 X선 회절, 질량 분석법, NMR과 같은 다른 분석법과의 시너지 효과를 활용하는 것이 매우 효과적입니다.

MicroED의 성공 비결은 사전 미팅과 측정 기간 중 참석입니다.

TARA에서 MicroED를 사용할 때 측정의 성공을 위해서는 사전 회의가 가장 중요합니다. 이상적으로는 시료의 상태 및 특성, 데이터 분석가의 전문성, 분석 목적, 의뢰인의 결정 분석 지식, MicroED의 기술적 한계 등과 같은 요소에 대한 명확한 공동 이해를 바탕으로 측정이 수행되어야 합니다.
"의뢰인과 충분한 정보를 공유한 후 측정을 시작하면 훨씬 원활한 측정이 이루어지는 경우가 많습니다. 물론, 의뢰인이 알고 싶어하는 내용을 검토한 후 MicroED로는 측정이 불가능한 경우에는 측정 요청을 거절하기도 합니다. 또한, 특정 검체에 대해 잘 아는 사람이 측정 과정에 참여하는 것이 매우 중요합니다. 검체만 제공되면 문제가 발생할 수 있습니다. 검체에 대한 정보가 부족하기 때문입니다. 측정 중에 문제가 발생할 경우, 검체를 잘 아는 사람이 여러 가지 상황에 대한 판단을 내려 측정을 성공적으로 마무리할 수 있도록 도와야 합니다."

저희는 마이크로ED를 위한 국가 센터를 설립하고자 합니다!

아다치 부교수는 2023년부터 여러 연구자들과 협력하여 "자동화를 통한 마이크로ED 표준화"를 주제로 연구를 진행해 왔습니다. 마이크로ED의 장단점을 모두 잘 아는 전문가인 그에게 앞으로의 포부에 대해 물어보았습니다.
"MicroED는 아직 새로운 기술이기 때문에 탐색해야 할 부분이 많습니다. TARA에서 공유 시설로서 극저온 전자현미경(cryo-EM)의 원활한 운영을 보장하는 것 외에도, 실시간으로 사용자 피드백을 경청하고 전용 장비의 장점을 활용하여 운영 시스템을 지속적으로 개선해 나가고자 합니다. 그리고 오사카 대학, SPring-8 등 다른 연구 기관에 TARA 시스템을 수출한 것처럼, 앞으로 더 많은 연구 기관으로 시스템을 적극적으로 확대해 나가고자 합니다. 궁극적으로는 TARA와 같은 수준의 극저온 전자현미경 10여 대를 갖춘 '국립 MicroED 센터'를 설립하여 미래에 더 많은 연구자들을 지원하고 싶습니다!"

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