형광 회복 용액이 있는 수지 CLEM에서

최근에는 형광염료와 형광단백질을 이용하여 광학현미경으로 다양한 생리현상과 생물학적 물질의 국소화 현상을 관찰하고 있다. CLEM은 동일한 시료를 광학현미경과 전자현미경으로 관찰하고 이러한 관찰 이미지를 병합하여 각 기기에서 얻은 정보를 통합하는 방법입니다. 따라서 이 이미지 병합에는 고정밀 정렬이 필요합니다. 그러나 광학현미경으로 관찰되는 형광염료 및 단백질의 형광은 전자현미경 관찰을 위한 시료준비(고정, 탈수, 수지 포매, 등), 광학현미경 관찰과 전자현미경 관찰은 서로 다른 조건에서 수행되어야 했다. CLEM-레드^*1 형광회복액(TUK solution)으로 처리하여 형광회복하는 형광단백질이다.^*2) glutaraldehyde나 osmium tetroxide로 고정한 후에도 이 형광이 레진에 포매된 후에도 유지된다. CLEM-Red와 형광회복액을 사용하여 레진 포매 후 초박절편을 형광현미경으로 관찰할 수 있어 고정밀 CLEM이 가능합니다.

프로토콜

^{* 1,2} CLEM-Red, TUK 솔루션은 Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation의 제품입니다.

결과

세포 내 불필요한 소기관과 단백질이 분해되는 현상을 오토파지(autophagy)라고 합니다. 이 자가포식에서는 불필요한 물질을 둘러싸고 있는 막 구조인 자가포식소체(autophagosome)가 관찰된다. p62 단백질이 이 autophagosome의 형성에 중요한 역할을 하는 것으로 제안되었습니다. Resin CLEM에서 p62와 CLEM-Red의 융합 단백질을 과발현하는 HeLa 세포가 관찰되었습니다.
이러한 관찰 결과, CLEM-red-p62 융합 단백질은 세포의 기름 방울 구조에 국한되었고, 인접 부위에는 자가포식소체가 형성되었다.

시료: Hela Cell, pCLEM-Red-p62
공초점 현미경: A1(Nikon)
주사형 전자 현미경: JSM-7900F(JEOL)

샘플 제공
Dr. Isei Tanida, Yasuo Uchiyama 교수(Juntendo 대학, 도쿄)

참조

타니다 I, 하루타 T, 슈가 M, 타케이 S, 타케베 A, 후루타 Y, 야마구치 J, 올리바
Trejo JA, Kakuta S, Uchiyama Y. 멤브레인 구조가 직접 접촉
p62/SQSTM1 본체 포함.
J 히스토켐 사이토켐. 2021년 69월; 6(407): 414-XNUMX.