가스 크로마토그래프 - 비행시간형 질량분석기(GC-TOFMS)를 사용한 사케 내 대사산물의 비표적 분석
엠에스팁 467호
개요
사케는 주로 쌀, 고메누룩, 물로 만든 일본의 알코올 음료입니다. 사케에는 알코올 외에도 아미노산, 유기산, 당분이 함유되어 있어 다양한 맛과 향을 만들어냅니다. 사케도 정미 비율과 증류주 첨가 여부에 따라 '다이긴조슈', '준마이슈', '혼죠조슈'로 분류되며, 다른 종류의 사케는 '후츠슈'로 분류됩니다. '1). 사케에 함유된 아미노산, 유기산, 당류는 고메누룩이나 효모 등 미생물의 대사에 의해 발생한다고 생각됩니다. 따라서 대사체 분석을 통해 이러한 종류의 사케를 분류하는 것이 가능할 수도 있습니다.
가스 크로마토그래프-질량 분석기(GC-MS)는 풍부한 데이터베이스, 쉬운 작동 및 높은 측정 재현성으로 인해 대사체학에 널리 사용됩니다. GC-MS의 측정 대상은 휘발성 화합물입니다. 그러나 트리메틸실릴화와 같은 유도체화 공정을 사용하여 당 및 아미노산과 같은 극성이 높은 대사산물을 측정할 수 있습니다. 또한, 대사체학 분야에서는 라이브러리 데이터베이스(DB)에 등록되지 않은 '알 수 없는 화합물'이 검출되는 경우도 있습니다. 이 경우 TOFMS(Time-of-Flight Mass Spectrometer)를 질량분석기로 사용하고 전자 이온화와 소프트 이온화를 결합한 '통합 분석'을 수행하면 알려지지 않은 화합물의 분자식도 알아낼 수 있습니다.2). 또한 인공지능(AI)을 활용해 화학 구조에서 EI 질량 스펙트럼을 예측하는 자동 구조 분석 소프트웨어 'msFineAnalytic AI'를 사용하면 구조식 추정이 가능하다.3).
이번 MSTips에서는 가스 크로마토그래프 비행 시간 질량 분석기(GC-TOFMS)를 사용하여 사케 내 대사산물의 비표적 분석 결과를 보고합니다.
실험
유도체화
시판 분류가 다른 4종의 사케(다이긴조슈, 준마이슈, 혼조조슈, 니고리슈)를 샘플로 사용했습니다. 니고리슈에 대해서는 원심분리(10℃, 12,000min, 20rpm)하여 상등액만을 시료로 사용하였다. 또한 모든 샘플을 동일한 양으로 혼합한 품질 검사(QC) 샘플도 준비했습니다. 각 시료 10μL에 내부표준물질로 1mg/mL 시나프산 메탄올 용액 100μL를 첨가하고 혼합하였다. 다음으로 증발기에서 건조시키고 데시케이터에서 하룻밤 방치하였다. 다음날, 각 시료에 20 mg/mL 메톡시아민 염산염 피리딘 용액 30 μL를 첨가하고 thermoshaker(90℃, 1200 min, 50 rpm)로 흔들어 주었다. 이후, N-메틸-N-(트리메틸실릴)트리플루오로아세트아미드(MSTFA) 37 μL를 첨가하고 다시 열 셰이커로 가열 및 진탕시켰다(30℃, 1200분, XNUMXrpm).
GC-MS 측정
측정에는 GC-TOFMS(JMS-T2000GC AccuTOF™ GC-Alpha, JEOL Ltd.)를 사용하였다. 우리는 EI/FI/FD 이온 소스 조합과 함께 EI 및 필드 이온화(FI) 모드를 모두 사용했습니다. 각 샘플에 대해 EI를 사용하여 n=3 측정을 수행하고 FI를 사용하여 n=1 측정을 수행했습니다. 기타 자세한 조건은 표 1과 같다.
데이터 처리
EI 데이터는 GC-MS 공통 형식 netCDF로 변환되었습니다. 이들 데이터는 대사체학 분석 프로그램인 MS-DIAL(Ver.4.9, RIKEN)을 이용하여 분석하여 피크를 검출하고 화합물을 동정하였다. 화합물 식별에는 EI, FI 데이터를 통합 분석할 수 있는 msFineAnalytic AI(JEOL Ltd.)를 활용해 보다 높은 정확도로 피크를 식별하고 오인을 방지했다. 화합물 식별 후 각 피크를 내부 표준 및 LOWESS로 정규화하고 각 샘플의 피크 강도를 내보냈습니다. 그런 다음 MetaboAnalyst 6.0에서 다변량 분석을 수행했습니다. 4). 다변량 분석은 AutoScaling으로 정규화한 후 주성분 분석과 계층적 군집분석을 수행하였다.
표 1 GC-MS 측정 조건
| GC | |
|---|---|
| 단 | HP-5MS UI(애질런트) 30m×0.25mm 내경, df=0.25μm |
| 입구 | 250°C, 다변량 분석의 경우: 분할 50:1, 화합물 식별용: 5:1 분할 |
| 오븐 | 80°C(2분)→15°C/분→325°C/분(7분) |
| 캐리어 흐름 | He, 1.0 mL/min(일정한 흐름) |
| MS | |
|---|---|
| 이온 소스 | EI/FI/FD 조합 이온 소스 |
| 이온화 | EI+:70eV, 300μA, FI+:-10kV, 10mA |
| m / z 범위 | 다변량 분석의 경우: m / z 33 - 800 화합물 식별의 경우: m / z 33 - 1600 |
결과 및 토론
TICC 비교 결과
그림 1은 EI 데이터의 TICC를 보여줍니다. 각 시료에는 글리세롤, 글리세릴글루코사이드 등의 당알코올, 포도당 등의 당류, 아미노산, 유기산 등 사케 특유의 화합물이 많이 검출되었습니다. 각 성분의 피크 강도는 샘플마다 다르기 때문에 다변량 분석을 수행했습니다.
*:외부 m / z 교정물질
그림 1 사케의 대사산물 TICC
주요 구성 요소 분석
그림 2는 LOWESS와 내부 표준으로 정규화된 데이터를 대상으로 MetaboAnalyst에서 수행한 PCA(Principal Component Analysis) 결과를 보여줍니다. 그림 2-A의 점수 플롯은 첫 번째 주성분(PC1)의 양수 및 음수 점수가 준마이슈 및 기타를 분류할 수 있음을 보여줍니다. 이는 사케 제조 시 증류주를 첨가하는지 여부에 따라 차이가 있을 수 있습니다. 또한, 두 번째 주성분(PC2)의 양성 점수와 음성 점수에 따라 다이긴죠슈 등을 분류하는 것이 가능해졌습니다. 이는 도정율의 차이에 따른 것으로 추정된다. 병에는 니고리슈의 분류가 기재되어 있지 않습니다. 그러나 니고리슈는 혼조조슈 근처에 계획되어 유사한 특징을 가지고 있을 수 있습니다.
그림 2 주성분 분석 결과 (A) Score 플롯, (B) Loading 플롯
계층적 클러스터 분석(HCA) 결과
HCA(Hierarchical Cluster Analysis) 결과의 히트맵은 그림 3과 같습니다. 히트맵은 각 성분의 존재비를 색상별로(빨간색: 높음, 파란색: 낮음) 표시하여 각 성분의 특성을 시각화할 수 있습니다. 견본. 예를 들어, 준마이슈의 특징적인 프롤린과 발린 화합물의 피크 강도 비교 결과는 그림 4에 나와 있습니다. 아미노산 프롤린과 발린은 사케의 쓴맛 성분으로 알려져 있습니다5). 준마이슈는 쌀, 고메코지, 물로만 만들어지며 증류된 알코올은 포함되어 있지 않습니다. 그러므로 일반적으로 쌀의 향미와 풍부함을 느낄 수 있는 맛이 있다고 합니다. 이번에 측정한 준마이슈 특유의 맛과 관련하여 발린과 프롤린이 연관되어 있을 가능성도 있습니다.
그림 3 계층적 군집 분석(HCA) 결과
그림 4 피크 강도 비교 결과
(A) 프롤린, (B) 발린
미지 화합물의 AI 구조 분석 결과
본 연구에서는 라이브러리 DB에 등록되지 않은 여러 화합물이 검출되었습니다. 예를 들어 그림 17.82에서 피크 RT 2분에 대한 통합 분석 및 구조 분석 결과를 설명합니다. 본조조슈의 이 화합물의 질량 스펙트럼은 그림 5에 나와 있습니다. 분자 이온 m / z 947은 EI에서는 검출되지 않고 소프트 이온화 FI에서만 검출되었습니다. 분자식은 C로 추정되었다.37H89아니11Si8 FI의 분자이온의 원소 조성 추정 결과로부터. 이 분자식은 환원성 이당류의 옥심 및 TMS 유도체화로부터 유래된 것으로 추정됩니다. 그러나 분자식이 일치하는 화합물과 라이브러리 DB의 히트 1위인 화합물(β-gentiobiose, octakis(trimethylsilyl) ether, methyloxime(이성질체 1))의 RI 값은 Δ169로 RI 값의 큰 차이가 있었습니다( 표 2). 따라서 이 구성요소는 분자식은 C이나, Library DB에 등록되지 않은 구성요소로 추정됩니다.37H89아니11Si8. 그림 6은 이 화합물의 AI 구조 분석 결과를 나타낸다. 첫 번째 후보는 이당류의 이소말툴로스 유도체였습니다. 이소말툴로스 유도체는 NIST 라이브러리에 등록되어 있지 않으므로 이 성분이 이소말툴로스일 가능성이 있습니다.
이번 보고서에서 FI는 EI를 이용한 대사체학 분석으로는 분석이 어려운 고질량 성분에 대해서도 분자이온을 명확하게 검출할 수 있었다. 또한 아직 라이브러리 DB에 등록되지 않은 상태에서도 구조식을 추정할 수 있었다.
그림 5 미지의 화합물의 질량 스펙트럼
표 2 미지 화합물의 통합 정성 분석 결과
그림 6 미지 화합물의 AI 구조 분석 결과
결론
이번 MSTips에서는 가스 크로마토그래프 비행 시간 질량 분석법(GC-TOFMS)을 사용하여 사케 내 대사산물의 비표적 분석 결과를 소개했습니다. 기존 GC-MS 측정으로는 측정하기 어려운 극성이 높은 대사산물도 TMS 유도체화를 통해 쉽게 측정할 수 있습니다. 또한 다변량 분석을 통해 사케의 분류가 가능해졌습니다. 분자량이 커서 GC-QMS로 측정하기 어려운 이당류의 TMS 유도체에 대해서도 GC-TOFMS와 FI를 이용하여 분자이온을 측정할 수 있었습니다. 라이브러리 DB에 등록되지 않은 화합물에 대해서는 미지 화합물 구조 분석 소프트웨어인 msFineAnalytic AI를 이용하여 구조식을 추정할 수 있었습니다.
위의 결과로부터 GC-MS를 이용한 대사체학 분야에서 GC-TOFMS와 msFineAnalytic AI가 효과적임을 확인하였다.
참조
1) 국세청 JAPAN. 2023. "술제조방법 품질표시기준"개요.
https://www.nta.go.jp/taxes/sake/hyoji/seishu/gaiyo/02.htm (일본어로 작성)
2) M. Ubukata 외, Rapid Commun Mass Spectrom. 2020; 34:e8820.
3) A.쿠보 외, 질량 분석, 2023, 12, A0120.
4) 메타보애널리스트 6.0. https://metaboanalyst.ca/
5) 오가와 하루오. 일본술의 성분과 향. 일본 냄새환경학회지 46권 5호, 2015年. (일본어로 작성)
