생명과학을 위한 CLEM
CLEM이란 무엇인가
CLEM(Correlative Light and Electron Microscopy)은 광학현미경(LM)과 투과전자현미경(TEM) 또는 주사전자현미경(SEM)으로 얻은 동일한 표본의 정보를 통합하여 효과적으로 관찰하고 분석하는 방법입니다. 이를 통해 관찰과 분석에 두 가지의 장점을 활용할 수 있습니다.
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CLEM 연마 / CLEM 밀링
주사전자현미경을 사용하여 연마나 이온 밀링 등을 통해 표면에 노출시켜 LM 이미지(광학 이미지)와 동일한 시야를 관찰하는 방법입니다. LM을 사용하여 세포의 전체 이미지 또는 형광 염색 이미지를 관찰한 후 SEM을 사용하여 세포 내부의 세부 구조를 관찰할 수 있습니다. 간단하고 광범위한 관찰이 가능한 것이 특징입니다. 전문 링키지 홀더를 사용하면 위치 정렬이 쉽습니다.
폴란드 CLEM / 밀링 CLEM 워크플로
세포를 마커가 있는 접시에서 배양하고 미리 고정하고 염색합니다. LM 관찰 후 준비 샘플을 홀더에 부착하고 좌표를 확인합니다. 관찰 표면은 연마 및 이온 밀링으로 노출시키고 SEM을 사용하여 관찰합니다.
이 기술이 적합한 응용 사례
- 세포 내부 구조 관찰
- 넓은 시야의 관찰
- 다점관찰
칩 CLEM
이는 광학 현미경(LM)과 투과 전자 현미경(TEM)을 모두 사용하여 동일한 시편 마운트(SiN 윈도우 칩)에서 초박 시편을 관찰하는 방법입니다. LM과 TEM으로 관찰하는 사이에 시편의 변형을 일으키는 프로세스가 없기 때문에 매우 정확한 오버레이가 가능합니다. 이 방법은 재료 분야에도 사용할 수 있습니다.
칩 CLEM 워크플로
온칩 CLEM은 TEM을 위해 준비된 초박편 시편을 SiN 윈도우 칩에 올려놓는 것입니다. SiN 윈도우 칩은 특수 리테이너를 사용하여 광학 현미경 및 TEM용 홀더에 부착할 수 있습니다. 특수 리테이너를 LM 홀더 및 TEM 홀더로 전환하여 LM・TEM 관찰을 쉽게 수행할 수 있습니다.
동일한 단면을 관찰할 수 있으므로 매우 정확한 상관관계를 얻을 수 있습니다.
이 기술이 적합한 응용 사례
- 초박절편을 제작한 후 형광이나 특수산란광을 관찰할 수 있는 표본
- 위상차 관찰이 가능한 시편
- 토너 입자(자가형광), 또는 결정질 폴리머 등
생물학적 표본이 아닌 것
LLP-클렘
Limitless Panorama(LLP)는 광학 현미경과 같이 외부에서 촬영한 이미지를 가져오는 기능이 있습니다. LLP는 LLP의 관찰 영역을 투과 전자 현미경의 표본 좌표와 일치시킬 수 있습니다. 각 관찰 이미지의 좌표를 일치시킨 후 LM에서 관찰한 영역의 몽타주 사진을 TEM을 사용하여 촬영합니다. 넓은 범위를 고해상도로 관찰할 수 있습니다.
LLP-CLEM 워크플로
마커가 있는 접시에서 배양된 세포는 미리 고정하고 염색합니다. LM 이미징 후, 후고정 및 레진 포매 후 표본의 표적 영역을 마커를 랜드마크로 사용하여 잘라냅니다. 초박 절편을 초박절편을 사용하여 준비하고 TEM을 사용하여 관찰합니다.
정렬은 촬영된 LM 이미지와 저배율 이미지의 TEM 이미지 사이에 공통된 3개 이상의 특징점을 지정하여 수행됩니다. 영역을 지정하고 LLP 이미징을 수행합니다.
이 기술이 적합한 응용 사례
- 넓은 시야의 관찰
- 소량의 돌연변이 세포 등을 찾습니다.
수지 CLEM
레진 CLEM은 형광 염색과 레진 포매 후 초박 절편을 제작하여 형광을 되살리고 광학현미경과 전자현미경(TEM/SEM)을 이용하여 동일한 절편을 관찰하는 기술이다. 형광을 되살리기 위해 형광 리바이버(TUK 용액)를 사용한다. 광학현미경과 전자현미경을 모두 이용하여 동일한 절편을 관찰할 수 있어 광학 및 전자현미경 이미지의 매우 정확한 중첩이 가능하다.
레진 CLEM 워크플로우
초박막 단면을 매끄러운 표면을 가진 SiN 윈도우 칩(TEM용) 또는 Si 웨이퍼 또는 슬라이드 글라스(SEM용)에 장착합니다. 형광 리바이버(TUK 용액)를 도포하고 광학 현미경으로 관찰한 다음 전자 현미경으로 관찰합니다.
이 기술이 적합한 응용 사례
- 형광 부활제를 사용하여 형광을 되살릴 수 있는 형광 단백질과 형광 염료의 도입이 가능한 배양 세포 및 조직.
- 세포소기관 내 단백질의 위치 파악 등 높은 정확도의 정렬이 필요한 샘플입니다.
다색 CLEM
유기 실리카 나노입자는 형광염료를 섞거나 중금속을 첨가하는 등 다양한 변형이 가능하다. 형광염료와 중금속을 함유한 유기 실리카 나노입자를 세포에 도입한다. 여러 종류의 중금속을 함유한 유기 실리카 나노입자는 EDS 맵핑을 통해 첨가된 중금속에 의해 구별할 수 있다. 따라서 광학현미경뿐만 아니라 전자현미경으로도 여러 가지 색상으로 관찰할 수 있다. 형광현미경으로 관찰한 영역을 전자현미경으로 자세히 관찰할 때 마킹으로 사용할 수도 있다.
다중 색상 CLEM 워크플로
유기 실리카 나노입자는 "녹색 형광 + 금 입자", "적색 형광 + 철 입자"와 같이 변형됩니다. 이를 배양 세포에 도입한 후 형광 관찰 및 EDS 매핑을 사용하여 동일한 영역을 확인할 수 있습니다.
이 기술이 적합한 응용 사례
- 대식세포형 세포가 실리카 나노입자를 식세포작용
- 파라메슘, 아메바 등 실리카 나노입자를 먹는 미생물
- 셀에 대한 표시가 가능합니다. 생체내에서 정맥 주사를 통해
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