Volume EM ~ 3D 재구성 ~

전자 현미경을 사용하여 3D 재구성을 통해 표본의 내부 구조를 관찰하고 분석하는 기술입니다. 전자 현미경을 사용한 3D 관찰 방법에는 두 가지가 있습니다. 첫 번째 방법은 연속적으로 촬영한 단면 이미지(어레이 토모그래피, 직렬 블록 페이스, FIB-SEM)를 쌓는 3D 재구성 방법이고, 다른 방법은 연속적으로 기울어진 표본의 투영 이미지에서 계산을 통한 3D 재구성(TEM 토모그래피)입니다.

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배열 단층 촬영

어레이 토모그래피는 생물학적 조직과 같은 표본의 3차원 정보를 제공합니다. 수지에 묻힌 표본은 연속적인 절편으로 슬라이스됩니다. 절편의 동일한 위치는 주사 전자 현미경(SEM)을 사용하여 관찰하여 이미지 스택을 만들고, 이는 3차원 재구성에 사용됩니다.

어레이 토모그래피 워크플로

직렬 블록면(SBF)

레진에 묻힌 생물학적 표본의 표면을 다이아몬드 나이프로 절단하고 SEM으로 관찰합니다. 절단과 관찰을 반복함으로써 두께 방향으로 SEM 이미지 시리즈를 얻을 수 있습니다. 이 SEM 이미지 시리즈를 쌓아서 3차원 재구성을 수행합니다. 나아가 대상 물체(전체 세포, 세포소기관 등)를 추출(분할)하면 수백 μms 범위에서 XNUMXD 구조가 드러납니다.
SEM 시편 챔버에 내장된 특수 슬라이싱 장치를 사용하면 절단 및 관찰을 자동으로 수행할 수 있습니다.

* Deerinck, TJ, Bushong, E., Thor, A. & Ellisman, MH 3D EM을 위한 NCMIR 방법: 연속 블록면 SEM을 위한 생물학적 표본 준비를 위한 새로운 프로토콜. 현미경(Oxf),6-8. (2010)

절단 및 관찰의 워크플로

FIB-SEM 방식 3D 재구성

FIB를 이용한 단면 분석과 SEM 이미지 획득은 연속적으로 수행됩니다. 3D 재구성은 연속적인 단면 SEM 이미지를 쌓아서 수행합니다. 이 방법은 샘플을 강력한 중금속으로 염색하고 수지에 매립해야 합니다. 이 방법의 장점은 높은 위치 정확도, 가공으로 인한 작은 왜곡, 높은 절단 분해능(20nm 미만) 및 다이아몬드 나이프로 절단하기 어려운 치아, 뼈 및 금속 임플란트와 같은 단단한 재료를 절단할 수 있는 능력입니다.

TEM 단층촬영

TEM으로 관찰한 시료의 두께는 100nm 이하이지만, 그 내부에는 시료의 두께보다 작은 미세 구조가 존재합니다. TEM 단층촬영법을 이용한 3차원 재구성은 시료의 연속적인 기울기에서 촬영한 투영 영상을 이용하여 계산을 통해 시료 내부의 3차원 구조를 고해상도로 재구성할 수 있습니다.